綠色熒光蛋白gfp的應(yīng)用
綠色熒光蛋白gfp的應(yīng)用主要集中在利用其熒光性質(zhì)的基礎(chǔ)上作為一種標(biāo)記物。
1綠色熒光蛋白gfp在分子生物學(xué)上的應(yīng)用
1.1綠色熒光蛋白gfp作為融合標(biāo)簽
綠色熒光蛋白gfpzui成功的一類應(yīng)用就是把綠色熒光蛋白gfp作為標(biāo)簽融合到主體蛋白中來檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用，或者靶向標(biāo)記某些細(xì)胞器。在多數(shù)情況下，綠色熒光蛋白gfp基因在n-或c-末端與異源基因用常規(guī)的分子生物學(xué)手段就可以接合構(gòu)成編碼融合蛋白的嵌合基因，其表達(dá)產(chǎn)物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現(xiàn)出與天然gfp相似的熒光特性。gfp的這種特性為蛋白質(zhì)提供了一種熒光標(biāo)記，不僅可以檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移，還可以研究蛋白質(zhì)分子的相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，并依靠熒光共振能量轉(zhuǎn)移即fret來進(jìn)行檢測。
1.2綠色熒光蛋白gfp作為報(bào)告基因
報(bào)告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的dna，如傳統(tǒng)的熒光素酶（lux）基因和β-葡萄糖苷酶（gus）基因。綠色熒光蛋白gfp作為基因報(bào)告可用來檢測轉(zhuǎn)基因效率，把綠色熒光蛋白gfp基因連接到目的基因的啟動子之后，通過測定gfp的熒光強(qiáng)度就可以對該基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。目前，此方法無論在農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中還是在活細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因胚胎和動物中都已得到非常廣泛的應(yīng)用，特別是在活細(xì)胞基因表達(dá)的時(shí)空成像方面。
2作為生物傳感器
2.1 檢測ph
野生型gfp和其許多突變體都具有依賴于ph的熒光變化，因而可以被用來檢測活細(xì)胞內(nèi)的ph。人們通常稱它們?yōu)閜hluprin。分為兩類：比率phluorin和盈缺phluorin。當(dāng)ph降低時(shí)，比率phluorin的zui大激發(fā)波長從395nm到475nm遷移，利用兩個(gè)zui大波長處的熒光強(qiáng)度的比率可以測量ph；當(dāng)ph值小于6時(shí)，盈缺phluorin在475nm處沒有熒光。當(dāng)ph回復(fù)到中性時(shí)，兩類phluorin都會在20ms內(nèi)復(fù)原。
2.2 檢測鹵素離子
yfp（h148q）變體不但對ph敏感而且對不同離子也同樣敏感，故可以用來檢測亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鹵素離子的濃度和傳遞
2.3 其他檢測應(yīng)用
另外，gfp可以應(yīng)用于檢測電位、氧化還原水平以及在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為ca2+指示劑
3綠色熒光蛋白gfp在細(xì)胞生物學(xué)上的應(yīng)用
綠色熒光蛋白gfp具有同宿主蛋白構(gòu)成融合子的性質(zhì)，利用這一性質(zhì)，可以將gfp定位到特定的細(xì)胞器和膜系統(tǒng)中，進(jìn)行細(xì)胞生理過程、細(xì)胞動力學(xué)等的實(shí)時(shí)觀測，或直接應(yīng)用于定量分析。目前，gfp已經(jīng)被成功地用于靶向標(biāo)記包括細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等在內(nèi)的細(xì)胞器。用gfp進(jìn)行亞細(xì)胞定位，避免了提純蛋白、標(biāo)記異硫氰酸熒光素等熒光染料、經(jīng)顯微注射或其他方式導(dǎo)入細(xì)胞的復(fù)雜方法，從而使研究蛋白在活細(xì)胞的準(zhǔn)確定位變得簡單易行。
4 綠色熒光蛋白gfp在篩選方面的應(yīng)用
4.1綠色熒光蛋白gfp用于細(xì)胞的篩選
基于gfp的熒光特性，并且熒光穩(wěn)定以及檢測方法快速、方便，gfp在細(xì)胞篩選上得到應(yīng)用廣泛。
4.2 綠色熒光蛋白gfp用于藥物的篩選
利用gfp對目的物進(jìn)行標(biāo)記，追蹤gfp，分析目的物在細(xì)胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而篩選出與體內(nèi)信號分子功能相似的化合物