小鼠膽管類器官
一、實驗?zāi)康?.熟練掌握小鼠膽管類器官原代建立技術(shù)。
2.了解掌握小鼠多種組織來源類器官原代建立技術(shù)。
3.觀察記錄小鼠膽管原代類器官生長、擴增過程中類器官形態(tài)的變化。
二、實驗原理本實驗策略采取從成體干細(xì)胞中建立和維持小鼠膽管類器官的方法。膽管上皮的自我更新是由位于肝臟的干細(xì)胞及其祖細(xì)胞的增殖所驅(qū)動的。小鼠膽管類器官表達膽管上皮在結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型組成和自我更新動力學(xué)方面的所有標(biāo)志，因此為小鼠肝臟發(fā)育和疾病的研究提供了巨大的希望。
三、實驗儀器、材料、試劑1. 儀器：生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫水平式離心機、倒置顯微鏡、低溫冰箱、搖床。
2. 材料：細(xì)胞培養(yǎng)板(規(guī)格為24孔、48孔和96孔)、離心管(規(guī)格為1.5ml、15ml和50ml)、細(xì)胞培養(yǎng)皿(直徑規(guī)格為2.5cm和6cm)、移液器(規(guī)格為2.5μl、10μl、20μl、200μl、1000μl和5000μl)、無菌吸頭(規(guī)格為10μl、200μl和1000μl)、無菌鑷子、無菌組織剪。
3.試劑：小鼠膽管類器官培養(yǎng)試劑盒(ma-0817h009hl/s)、組織消化液(mb-0818l06s-100)、潤洗液(mb-0818l03l/s)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基(mb-0818l07)、胎牛血清、dpbs、基質(zhì)膠(082701/082703/082755)、紅細(xì)胞裂解液(mb-0818l08l/s)。
四、實驗內(nèi)容與方法
01 實驗前準(zhǔn)備小鼠膽管類器官培養(yǎng)試劑盒(ma-0817h009hl/s)、基質(zhì)膠(082701/082703/082755)4℃化凍；
小鼠膽管類器官培養(yǎng)基的制備：將200μl mouse liver ductal organoid supplementb (50x)，40μl mouse liver ductal organoid supplement c (250x) 加至9.76ml mouseliver ductal organoid basal medium中，充分混合，配制成10ml小鼠膽管類器官培養(yǎng)基，室溫平衡，可在2-8°c儲存，建議在兩周內(nèi)使用；
準(zhǔn)備足量添加1%雙抗的dpbs；
配制10ml組織消化液，現(xiàn)配現(xiàn)用，37℃搖床混勻預(yù)熱，未用完消化液可-20℃保存1周（mogengel：10ml基礎(chǔ)液+添加物500μl)。
02 組織樣本收集小鼠斷脊處死，表面噴灑酒精殺菌，在無菌條件下將膽管第一大肝葉取出，用刀片切下1/2肝葉，放入4℃預(yù)冷的dpbs溶液中。
03 組織清洗用冰冷的dpbs清洗2~3次，將組織轉(zhuǎn)移到新的6cm培養(yǎng)皿或1.5ml ep管中，用無菌組織剪將組織剪成約0.5mm3的碎片。
04去除雜質(zhì)細(xì)胞將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，并加入約10ml冰冷的basal medium。用5ml移液管上下吹打樣品，以去除紅血球和脂肪(它們會漂浮到溶液的頂部)。后讓組織碎片沉降5~7分鐘，并棄去約7.5ml的上清液，包括任何漂浮的脂肪， 后重復(fù)此洗滌步驟1~2次。
05消化液消化將剪碎的組織用適量的原代組織液消化液(mb-0818l06s-100)重懸，并轉(zhuǎn)移至新的離心管內(nèi)，于37℃，100rpm條件下的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，消化20-30分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多膽管結(jié)構(gòu)即可終止消化，若組織碎塊較大或消化不可適當(dāng)延長消化時間。消化期間可以使用不同規(guī)格的移液器吹打組織消化懸液，幫助充分消化。
06終止消化在消化完成的組織懸液中加入胎牛血清（fetal bovine serum, fbs）至終濃度達1%~5%以減緩消化作用，同時輕輕吹打5~10次。
07靜置收集靜置3-10min，待組織碎片自然沉降后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的15ml離心管中，剩余組織碎片中加入1ml冰冷的basal medium吹打5~10次，靜置1min待組織碎片自然沉降后，將上清收集至離心管中。在8℃下以250g的速度離心3min，棄去上清以洗去殘留的消化液。若所獲細(xì)胞沉淀呈紅色，說明其中包含紅細(xì)胞，則需在清洗前于沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液(mb-0818l08l/s)裂解紅細(xì)胞，并于250g離心力離心3分鐘，吸去上清液保留沉淀，再對沉淀進行清洗。
08類器官收集用含有抗生素的pbs或基礎(chǔ)培養(yǎng)基(mb-0818l07)清洗細(xì)胞2次（混勻后250g離心力離心，3分鐘，棄去上清液）以除去fbs。
09基質(zhì)膠3d包裹將清洗后的細(xì)胞沉淀用含有抗生素的pbs或基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，取少量懸液進行活細(xì)胞檢測和計數(shù)，并按照100,000~500,000個細(xì)胞/ml的密度加入細(xì)胞外基質(zhì)（>70%）并在冰上混勻，混勻后置于冰上。
注意：混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)。
10種板培養(yǎng)用移液器吸取細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的混合液移至細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，（如24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔點20~30μl混合懸液，48孔板每孔點12.5~18μl混合懸液，96孔板孔板每孔點3~5μl混合懸液），混合懸液須點至培養(yǎng)孔底部中央位置，其鋪開后不可接觸培養(yǎng)孔側(cè)壁。將培養(yǎng)板放入37℃，在5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20分鐘，待細(xì)胞外基質(zhì)凝固至不再流動后，沿孔壁緩緩加入培養(yǎng)基，(如24孔板加500μl培養(yǎng)基，48孔板加250μl培養(yǎng)基，96孔板加100μl培養(yǎng)基)，p0代培養(yǎng)3~4天換液。
11持續(xù)培養(yǎng)將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每1天于倒置顯微鏡下觀察類器官的生長狀態(tài)，每3天于倒置顯微鏡下拍照，記錄多個視野中的類器官的形態(tài)和分布。
五、小鼠膽管類器官培養(yǎng)推薦試劑