中華人民共和國國家標準
gb/t 20746-2006
牛、豬的肝臟和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代謝物殘留量的測定
液相色譜-串聯質譜法
method for the determination of the residues of carbadox,olaquindox and related metabolites in bovine and porcine liver and muscle tissues-
lc-ms-ms method
前言
本標準的附錄a和附錄b為資料性附錄。
本標準由中華人民共和國秦皇島出入境檢驗檢疫局提出。
本標準由中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局歸口。
本標準起草單位：中華人民共和國秦皇島出入境檢驗檢疫局中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局。
本標準主要起草人：龐國芳、謝麗琪、歐陽姍、藍芳、林黎、涂小珂。
本標準系首（shou）次發(fā)布的國家標準。
1范圍
本標準規(guī)定了牛、豬肝臟和肌肉中卡巴氧及其代謝物脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸和喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留量的液相色譜-串聯質譜測定方法。
本標準適用于牛、豬肝臟和肌肉中卡巴氧及其代謝物脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸和喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留量的測定。
本標準的方法檢出限：卡巴氧、脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸均為0.5μg/kg。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。
gb/t 6379.1測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第1部分：總則與定義(gb/t 6379.1-2004，iso 5725-1：1994，idt)
gb/t 6379.2測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法(gb/t 6379.2-2004，iso 5725-2：1994，idt)
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法(gb/t 6682-1992，neq iso 3696：1987)
3.原理
用乙腈+乙酸乙酯(1+1)溶液提取肌肉和肝臟組織中的卡巴氧，提取液經正己烷脫脂后，旋轉蒸發(fā)至干，殘渣用甲酸(0.1%)+甲醇(19+1)溶液溶解。樣液供液相色譜-串聯質譜儀測定，內標法定量。用甲酸溶液消化試樣，使組織中天然存在的酶失活，然后加入蛋白酶水解，鹽酸酸化，離心過濾后，過oasis max固相萃取柱或相當者凈化。先用二氯甲烷洗脫脫氧卡巴氧，再用2%甲酸乙酸乙酯溶液洗脫喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸，氮氣吹干洗脫液，殘渣用甲酸+甲醇(19+1)溶液溶解，樣液供液相色譜-串聯質譜儀測定，內標法定量。
4試劑和材料
除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級水。
4.1甲醇：色譜純。
4.2乙腈：色譜純。
4.3甲酸：色譜純。
4.4正己烷。
4.5乙酸。
4.6濃鹽酸。
4.7乙酸鈉。
4.8二甲基甲酰胺。
4.9乙酸乙酯。
4.10中性氧化鋁：200目~300目。
4.11乙腈+乙酸乙酯溶液(1+1)。
4.12甲酸乙酸乙酯溶液：2%。向400 ml乙酸乙酯中加入10 ml甲酸，用乙酸乙酯定容至500 ml。
4.13甲酸溶液：0.6%。量取6.0 ml甲酸，用水溶解、定容至1 l。
4.14甲酸溶液：0.1%。量取1.0 ml甲酸，用水溶解、定容至1 l。
4.15甲酸+甲醇溶液(19+1)。用190 ml甲酸溶液(4.14)與10 ml甲醇(4.1)混合。
4.16鹽酸溶液：0.1 mol/l。量取8.3 ml濃鹽酸，用水溶解定容至1 l。
4.17鹽酸溶液：0.3 mol/l。量取25 ml濃鹽酸，用水溶解定容至1 l。
4.18protease蛋白酶：sigma p5147或相當者，-18℃以下保存。
4.19蛋白酶水溶液：0.01 g/ml。稱取1.00 g protease蛋白酶(4.18)，用水溶解、定容至100 ml，4℃保存。
4.20乙酸溶液：10%。量取100 ml甲酸，用水溶解、定容至1 l。
4.21乙酸鈉溶液：0.05 mol/l，ph =7。稱取6.8 g乙酸鈉用800 ml水溶解，再滴加10%乙酸溶液以調節(jié)溶液ph=7，用水定容至1 l。
4.22乙酸鈉+甲醇溶液(19+1)。用190 ml乙酸鈉溶液(4.21)與10 ml甲醇(4. 1)混合。
4.23甲醇+水溶液(1+4)。
4.24tris堿：sigma t1503或相當者。
4.25 tris溶液：1.0 mol/l。稱取121 g tris堿，用水溶解、定容至1 l，4℃保存。
4.26卡巴氧、脫氧卡巴氧、喹噁啉-2羧酸、3-甲基喹噁啉-2羧酸、喹噁啉-2羧酸-d4標準物質：純度≥99%。
4.27標準儲備溶液：100 mg/l。準確稱取適量標準物質，卡巴氧用二甲基甲酰胺溶解定容，其余標準物質分別用甲醇溶解定容，配成100 mg/l的標準儲備液，在-18℃保存，可使用1年。
4.28基質混合標準工作溶液：根據靈敏度和使用需要，用空白樣品提取液配成不同濃度(μg/l)的基質混合標準工作溶液，在4℃保存，可使用1周。
4.29內標工作溶液：準確稱取適量內標標準物質，用甲醇溶解定容，配成100μg/l的標準工作溶液，在4℃保存，可使用1周。
4.30陰離子交換柱：oasis max 60 mg，3 ml，或相當者。用前分別用3 ml甲醇和3 ml水活化，保持柱體濕潤。
4.31濾膜：0. 2μm。
5儀器
5.1液相色譜-串聯質譜儀：配有電噴霧離子源。
5.2固相萃取裝置。
5.3氮氣濃縮儀。
5.4液體混勻器。
5.5分析天平：感量0.1 mg和0.01 g。
5.6真空泵。
5.7均質器。
5.8移液器：10μl~100μl和100μl~1 000μi。
5.9聚丙烯離心管：50 ml，具塞。
5.10 ph計：測量精度士0.02 ph單位。
5.11低溫離心機：可制冷到4℃。
5.12玻璃離心管：15 ml。
6試樣制備與保存
6.1試樣的制備
將牛、豬肝臟和肌肉組織樣品充分攪碎，均質，分出0.5 kg作為試樣，置于清潔樣品容器中，密封，并做上標記。
6.2試樣的保存
將制備好的試樣于-18℃以下保存。
7測定步驟
7.1卡巴氧的前處理步驟
7.1.1稱取5 g試樣，精確至0.01 g。置于50 ml聚丙烯離心管中，加入5 g中性氧化鋁(4.10)。
7.1.2加入25 ml乙腈+乙酸乙酯溶液(4.11)，于液體混勻器上充分混合5 min，以5 000 r/min離心5 min，將上清液移取至另一干凈的50 ml離心管，加入10 ml正己烷(4.4)到管內，振蕩2 min，以5 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，將下層清液轉移至150 ml雞心瓶中。
7.1.3重復7.1.2步驟一次，合并兩次提取液于同一雞心瓶中，加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d4標準溶液(4.29)，使其濃度為2. 0 ng/g，40℃水浴，減壓旋轉蒸發(fā)至干。
7.1.4準確加入1.0mi.甲酸+甲醇溶液(4.15)溶解殘渣，過0.2μm濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。
7.2脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸的前處理步驟
7.2.1稱取5 g試樣，精確至0.01 g。置于50 ml聚丙烯離心管中，加入10 ml 0.6%甲酸溶液
(4.13)，混勻后，置于(47±3)℃振蕩水浴中振搖1 h；先加入3 ml 1.0 mol/l tris溶液(4.25)混勻，再加入0.3 ml蛋白酶水溶液(4.19)，充分混勻后，置于(47±3)℃振蕩水浴中酶解16 h~18h。加入20ml 0.3mol/l鹽酸溶液(4.17)，振蕩5min，在10℃以5000r/min離心15min，上清液過濾。
7.2.2將濾液(7.2.1)移入oasis max固相萃取柱(4.30)中，待樣液全部流出后，用30ml乙酸鈉+甲醇溶液(4.22)淋洗固相萃取柱，真空抽干15 min。
7.2.3在一支干凈的玻璃管內加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d4標準溶液(4.29)，使其濃度為2.0 ng/g，再用4×3 ml二氯甲烷將脫氧卡巴氧洗脫至管內，在45℃用氮氣濃縮儀吹干。
7.2.4固相萃取柱再用3×3 ml甲醇、3 ml水、3×3 ml 0.1 mol/l鹽酸溶液(4.16)和2×3 ml甲醇+水溶液(4.23)分別淋洗，真空抽干15 min，然后用2 ml乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱，棄去全部淋出液，最后用3 ml甲酸乙酸乙酯溶液(4.12)洗脫喹噁啉-2羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸到7.2.3所用試管中，在45℃用氮氣濃縮儀吹干。準確加入1.0 ml 0.1%甲酸+甲醇溶液(4.15)溶解殘渣，過0.2μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。
7.3色譜測定
7.3. 1液相色譜條件
a)色譜柱：inertsil ods-3，3μm，100 mm×2.1 mm (內徑)或相當者；
b)流動相：甲醇乙腈以及0.1%甲酸溶液，梯度洗脫條件見表1；
c)流速：0.2 ml/min；
d)柱溫：30℃；
e)進樣量：30μl。
7.3.2質譜條件
a)離子源：電噴霧離子源；
b)掃描方式：正離子掃描；
c)檢測方式：多反應監(jiān)測；
d)分辨率：單位分辨率；
e)電噴霧電壓：5 000 v；
f)霧化氣流速：8.0 l/min；
g)氣簾氣流速：7.0 l/min；
h)輔助氣流速：5.0 l/min；
i)離子源溫度：450℃；
j)定性離子對、定量離子對及其他質譜參數見表2。
7.4液相色譜-串聯質譜測定
7.4.1定性測定
每種被測組分選擇1個母離子，2個以上子離子，在相同試驗條件下，樣品中待測物質的保留時間，與混合標準工作溶液中對應的保留時間偏差在±2.5%之內，各分析化合物的參考保留時間見表3；樣品中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的混合標準工作溶液中對應的定性離子的相對豐度進行比較，若偏差不超過表4規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。
7.4.2定量測定
用混合標準工作溶液(4.28)分別進樣，以分析化合物和內標化合物的峰面積比為縱坐標，以分析化合物和內標化合物的濃度比為橫坐標作標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量，樣品溶液中卡巴氧、脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸的響應值均應在儀器測定的線性范圍內?？ò脱酢⒚撗蹩ò脱?、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2羧酸的標準總離子流圖見圖a.1。
7.5平行試驗
按以上步驟，對同一試樣進行平行試驗測定。
7.6回收率試驗
陰性樣品中添加標準溶液，按步驟7.1~7.4操作，測定后計算樣品添加的回收率。
8結果計算
試樣中每種化合物殘留量利用數據處理系統計算或按式(1)計算，計算結果應扣除空白值：
式中：
x——試樣中被測物殘留量，單位為微克每千克(μg/kg)；
cs——基質標準工作溶液中被測物的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；
a——試樣溶液中被測物的色譜峰面積；
as——基質標準工作溶液中被測物的色譜峰面積；
ci——試樣溶液中內標物的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；
csi——基質標準工作溶液中內標物的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；
asi——基質標準工作溶液中內標物的色譜峰面積；
ai——試樣溶液中內標物的色譜峰面積；
v——樣液最終定容體積，單位為毫升(ml)；
m——試樣溶液所代表試樣的質量，單位為克(g)。
注：計算結果應扣除空白值。
9精密度
本標準的精密度數據是按照gb/t 6379.1和gb/t 6379.2的規(guī)定確定的，重復性和再現性的值以95%的可信度來計算。
9.1重復性
在重復性條件下，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不超過重復性限r，組織中四種分析化合物的含量范圍及重復性方程見表5。
9.2再現性
在再現性條件下，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不超過冉現性限r，組織中四種分析化合物的含量范圍及再現性方程見表5。