dna重組技術(shù)（連接）
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>體外連接獲得重組分子，用于轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。
二、實(shí)驗(yàn)原理
dna重組技術(shù)是用內(nèi)切酶分別將載體和外源dna切開，經(jīng)分離純化后，用連接酶將其連接，構(gòu)成新的dna分子。
外源dna片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：
1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端，這也是最容易克隆的dna片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源dna片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在pcr擴(kuò)增時(shí)，在dna片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。
2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體dna均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物，而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種dna的濃度，以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到高的水平。還可將載體dna的5'磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉，max大限度地抑制質(zhì)粒dna的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源dna片段可以有效地與去磷酸化的載體相連，產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子，在轉(zhuǎn)入e.coli受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動(dòng)修復(fù)。
3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由dna聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，t4 dna連接酶的濃度和外源dna及載體dna濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(peg 8000)以促進(jìn)dna分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。
特殊情況下，外源dna分子的末端與所用的載體末端無(wú)法相互匹配，則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源dna片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配， 也可以有控制的使用e. coli dna聚合酶ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端，使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。
三、 主要試劑
t4 連接酶、無(wú)菌水、質(zhì)粒和pcr的酶切產(chǎn)物。
四、儀器耗材
微量移液槍，tip、eppendorf管、低溫水浴鍋。
五、 連接反應(yīng)
質(zhì)粒酶切產(chǎn)物 1
pcr酶切產(chǎn)物4
t4 ligase 1
10×bf 1
h2o 3
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total 10 μl
六、注意事項(xiàng)
1. 操作時(shí)，注意保持低溫狀態(tài)，因?yàn)閘igase酶很容易降解。
2. 連接反應(yīng)，一般14-16℃，o/n.
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