一、pcr是什么
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的dna（或rna）片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊dna復(fù)制，pcr的最大特點(diǎn)，是能將微量的dna大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的dna，就能用pcr加以放大，進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。
pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用dna在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°c左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至dna聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°c左右），dna聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈。基于聚合酶制造的pcr儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。
二、pcr原理
基本反應(yīng)原理
從專業(yè)的角度來說，pcr 由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
1模板 dna 的變性：模板 dna 經(jīng)加熱至 94℃ 左右一定時(shí)間后，使模板 dna 雙鏈或經(jīng) pcr 擴(kuò)增形成的雙鏈 dna 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；
2模板 dna 與引物的退火 （復(fù)性）：模板 dna 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板 dna 單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
3引物的延伸：dna 模板--引物結(jié)合物在 taq 酶的作用下，以 dntp 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 dna 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復(fù)制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 2～4 分鐘， 2～3 小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。
三、pcr的基本反應(yīng)步驟
1.引物的設(shè)計(jì)：
引物需要自己查找文獻(xiàn)或者自己設(shè)計(jì)，然后交給合適的生物公司來幫我們合成，合成引物，每管裝1od。拿到引物后需要加水溶解，但是因?yàn)橐锸强床灰姷?，所以為了防止溶解過程中引物的丟失，拿到引物后最好先高速離心（10000rpm, 4°c離心2min）再進(jìn)行加水溶解（ddh2o）。水的體積按引物濃度稀釋100倍，溶解好的引物用小管分裝，每管裝50μl即可，分裝后放-20°c保存。
2.制作模板：
模板的制作可以直接借助試劑盒，一般情況下trizol的試劑可以需要，直接按照試劑盒提示來做就可以了。
3.建立體系、上機(jī)：
pcr需要用到的dna聚合酶、buffer、dntps。而經(jīng)常用的dna聚合酶有taq酶，買的同時(shí)會(huì)附送10×buffer(主要成分是kcl、tris-hcl和mgcl2，有些還有(nh4)2so4)。做pcr之前要提醒大家一點(diǎn)，不是所有的pcr都用同樣的反應(yīng)體系的，也就是說pcr體系里用到的試劑除了10×taq buffer以外，其它其實(shí)都是需要摸條件的，但是按大多數(shù)情況來說，需要調(diào)整的并不多，可能需要調(diào)整的主要試劑是mgcl2（其實(shí)是要調(diào)整mg2+的濃度）；可能需要控制的條件主要是退火溫度。
4.跑膠驗(yàn)證：
在電泳之前，需要進(jìn)行凝膠的配制，凝膠液配制的過程并不復(fù)雜，先用天平稱取適量的瓊脂糖粉末，加入到一定體積的1×tae（tris、乙酸、edta）緩沖液中，微波爐加熱至沸騰，拿出來搖勻，幫助粉末溶解，反復(fù)沸騰多次直到粉末溶解。待溶液不燙手，將核酸染料加入溶液中搖勻，接著將溶液趁熱倒到做膠的凝膠板上，插上梳子（用來預(yù)留加樣孔），等半小時(shí)左右膠凝固拔下梳子，連膠帶板一起放到電泳槽中，加電泳液至淹沒整塊凝膠（電泳槽中的電泳液也用1×tae緩沖液）。然后將loading buffer與樣品混合，加入到凝膠小空（“梳子”形成的洞）中，dna maker作為對(duì)照，同樣加入到篩孔中，然后插上電源開始跑膠就可以了，凝膠上有顏色的有兩條帶，等到前面的藍(lán)色帶跑到整塊膠的2/3處停止電泳（斷電），然后把膠拿出來，放到紫外光下觀察條帶。