中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
qb/t 5759-2022
番茄醬罐頭中番茄紅素含量測(cè)定
高效液相色譜法
determination of lycopene in canned tomato paste-hplc method
前言
本文件按照gb/t1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
本文件由中國(guó)輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)提出。
本文件由全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)罐頭分技術(shù)委員會(huì)（sactc 64/sc2）歸口。
本文件起草單位：上海交通大學(xué)、中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司、廈門(mén)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院、華測(cè)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)股份有限公司、新疆新康農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司、中糧新疆屯河加工番茄工程技術(shù)研究中心（有限公司）、新疆冠農(nóng)果茸股份有限公司、山西仲測(cè)計(jì)量研究院有限公司、漳州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心、中國(guó)罐頭工業(yè)協(xié)會(huì)。
本文件主要起草人：王正武、仇凱、方榮謙、張維、東思源、柴平海、高靜、何旻霞、譚奇敏、劉中海、吳二豪、王登飛、晁曦、常迪、童躍聰、孫字、戚晨晨、高紅波、崔海濱、肖莉、楊偉敏、陳泳、陳其鋼、申玥琦、張國(guó)玉、周璇、張宇聰、趙婭鴻。
本文件為首次發(fā)布。
1范圍
本文件描述了采用高效液相色譜法測(cè)定番茄醬罐頭中番茄紅素含量的方法。
本文件適用于采用高效液相色譜法進(jìn)行番茄醬罐頭中番茄紅素含量的測(cè)定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。
3術(shù)語(yǔ)和定義
本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。
4原理
試樣在堿性溶液中皂化，經(jīng)鹽酸溶液中和至中性，用有機(jī)溶劑萃取試樣中的番茄紅素，合并有機(jī)相并進(jìn)行濃縮，經(jīng)c30色譜柱分離，高效液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。
5試劑
除另有說(shuō)明外，所有試劑均為分析純，水為gbt 6682規(guī)定的一級(jí)水。
5.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
5.2甲基叔丁基醚（c5h12o）：色譜純。
5.3二氯甲烷（ch2cl2）。
5.4濃鹽酸（hcl）。
5.5無(wú)水乙醇（c2h6o）。
5.6氯化鈉（nacl）。
5.7氫氧化鈉（naoh）。
5.8 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（bht）。
5.9石油醚：沸程60℃~90℃。
5.10番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品（cas 502-65-8）：包含13z-番茄紅素、9z-番茄紅素、全反式-番茄紅素、
5z-番茄紅素混合物，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度大于95%。
5.11氫氧化鈉溶液（0.5 mol/l）：稱取20g（精確至0.01g）氫氧化鈉（5.7）于500 ml燒杯中，加適量水溶解，待溶液恢復(fù)至室溫后，轉(zhuǎn)移至1 000 ml容量瓶中定容至刻度。
5.12鹽酸溶液（0.6 mo/l）：準(zhǔn)確量取25.0ml濃鹽酸（5.4）于500 ml容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度。
5.13 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（bht）-二氯甲烷溶液（5g/l）：準(zhǔn)確稱取0.5g（精確到0.01 g）2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（bht）（5.8）于燒瓶中加適量二氯甲烷（5.3）溶解，轉(zhuǎn)移至100 ml棕色容量瓶中，用二氯甲烷（5.3）定容至刻度。
5.14番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100 mg/l）：分別準(zhǔn)確稱取5 mg（精確至0.1 mg）番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)晶（5.10）和10mg2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（bht）（5.8）（精確至0.1 mg）于燒杯中，用少量二氯甲烷（5.3）溶解，完全轉(zhuǎn)移至50 ml棕色容量瓶中并定容刻度，-20℃避光保存，24 h內(nèi)可使用。
5.15番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液：量取1.0 ml（va）番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.14），置于50ml（vb）棕色容量瓶中，加入5.0 ml無(wú)水乙醇（5.5）和5.0ml 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（bht）-二氯甲烷溶液（5.13），用石油醚（5.9）定容，混勻后將溶液置于1 cm比色皿中，以石油醚（5.9）作空白對(duì)照，用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)在472 nm處測(cè)定吸光度。吸光度應(yīng)控制在0.3~0.7，否則應(yīng)調(diào)整溶液濃度，再重新測(cè)定吸光度。番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度ρst，按公式（1）計(jì)算：
式中：
ρst——番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/l）；
amax——番茄紅素溶液在472 nm附近的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度值；
d——稀釋因子（ve/va）；
10 000——濃度換算因子；
3 450——番茄紅素的吸光系數(shù)。
5.16番茄紅素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取0ml、0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.0 ml番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.14），用二氯甲烷（5.3）定容至10 ml，得到質(zhì)量濃度為0μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/mll、8.0μgml、10.0μg/ml的番茄紅素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
番茄紅素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度按照標(biāo)定的實(shí)際濃度計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍可根據(jù)標(biāo)定濃度適當(dāng)調(diào)整。
6儀器和材料
6.1高效液相色譜儀：配備紫外檢測(cè)器（uv）。
6.2電子天平：感量0.1 mg和0.01 g。
6.3磁力攪拌器。
6.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
6.5渦旋混合器。
6.6振蕩器。
6.7 ph計(jì)。
6.8高速離心機(jī)。
6.9有機(jī)微孔濾膜：孔徑0.45μm。
7分析步驟
7.1樣品前處理
稱取0.5g樣品（精確至0.01g）于50ml離心管中，加入5 ml氫氧化鈉溶液（5.11）溶解混勻（渦旋混合器），25℃室溫皂化30 min，分別加入15ml水和2g氯化鈉（5.6），用振蕩器充分振蕩使溶液分散均勻，用鹽酸溶液（5.12）中和至ph=7.0（ph=7±0.1，20℃，ph計(jì)），加入20 ml2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（bht）-二氯甲烷溶液（5.13），用振蕩器振蕩10 min，置于4 000 r/min高速離心機(jī)離心3 min，用玻璃吸管將下層有機(jī)溶液全部轉(zhuǎn)移至250 ml圓底燒瓶中，在上層水相和殘?jiān)屑尤?0 ml 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（bht）-二氯甲烷溶液（5.13），重復(fù)以止操作3次，直至水相和殘?jiān)鼰o(wú)色，合并有機(jī)相。
將圓底燒瓶中的有機(jī)溶液在40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮旋蒸至約2 ml，將溶液轉(zhuǎn)移至10 ml的棕色容量瓶中，用2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（bht）仁氯甲烷溶液（5.13）潤(rùn)洗圓底燒瓶至少3次，合并潤(rùn)洗液并定容，濾液經(jīng)0.45μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，用于液相色譜檢測(cè)。
7.2儀器參考條件
7.2.1色譜柱：c30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）或性能相當(dāng)者。
7.2.2流動(dòng)相：a為甲醇，b為甲基叔丁基醚：三乙胺-100：0.05（體積比）
7.2.3流速：1.0 ml/min.
7.2.4檢測(cè)波長(zhǎng)：472 nm。
7.2.5柱溫：30℃。
7.2.6進(jìn)樣量：10μl。
7.2.7梯度洗脫條件，見(jiàn)表1。
表1梯度洗脫程序表
時(shí)間/min
a/（%）
b/（%）
0
80
20
15
65
35
20
45
55
24
35
65
30
32
68
37
20
80
39
10
90
42
10
90
43
80
20
48
80
20
7.3定性分析
分別將番茄紅素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.16）和經(jīng)7.1制備的試樣溶液進(jìn)樣測(cè)定，以番茄紅素的保留時(shí)間定性，定性色譜圖見(jiàn)附錄a。
7.4外標(biāo)法定量
將7.1制備的試樣注入高效液相色譜儀，測(cè)定試樣中各組分譜峰面積，以番茄紅素標(biāo)定后的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，以番茄紅素各異構(gòu)體的峰面積和為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算試樣中番茄紅素的含量。
7.5結(jié)果計(jì)算
將樣品中番茄紅素的含量按公式（2）計(jì)算：
式中：
x——桃合一樣品中番茄紅素的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；
ρ——待測(cè)溶液中番茄紅素總質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（μg/ml）；
v——溶液的定容體積，單位為毫升（ml）；
100——換算因子；
m——樣品質(zhì)量，單位為克（g）；
1000——換算因子。
測(cè)定結(jié)果取兩次測(cè)定的算術(shù)平均值，計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后2位。
7.6精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)其算術(shù)平均值的10%。
7.7檢出限和定量限
本文件中番茄紅素的檢出限為0.30 mg/100g，定量限為1.00 mg/100g。