：人工合成的系列偶氮類工業(yè)染料，分為ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ號。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將ⅳ號列為三類致癌物，其初級代謝產(chǎn)物鄰氨基偶氮甲苯和鄰胺均列為二類致癌物，均有一定的潛在致癌作用。
近年來歐盟和我國都嚴(yán)禁使用作為食品添加劑，參考國家標(biāo)準(zhǔn)gb/t19681-2005《食品中染料的檢測方法高效液相色譜法》，我們采用反相高效液相色譜儀對i號、ii號和iv號進(jìn)行了測定。
1、方法原理
樣品經(jīng)溶劑提取、固相萃取凈化后，用反相高效液相色譜—紫外可見光檢測器進(jìn)行色譜分析，采用外標(biāo)法定量。
2、主要儀器和試劑
1）【上分】牌高效液相色譜儀，二元高壓梯度；
2）電子天平；
3）超聲波水?。?br>4）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，5）離心機(jī)，6）檢測專用固相萃取柱；
6）標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈配制成10µg/ml的標(biāo)準(zhǔn)貯備液待用。
3、 實(shí)驗(yàn)方法
3.1樣品制備
3.1.1樣品提取準(zhǔn)確稱取咸鴨蛋黃1.0g于三角瓶中，加入10ml正己烷，渦旋1min后振蕩5min，超聲5min，4000r/min離心5min，收集上清液。下層殘留物用10ml正己烷按上述步驟重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，再加入5ml正己烷混勻，待用。
3.1.2spe柱凈化：
1）活化：檢測柱使用前用10ml正己烷活化；
2）上樣和洗脫：檢測柱上加入待凈化液，棄去流出液；依次加入5ml正己烷、5ml1%乙酸乙酯正己烷淋洗，棄去淋洗液；再加入10ml30%乙酸乙酯-正己烷溶液，收集洗脫液。（整個上樣洗脫過程均保持流速1ml/min)
3）洗脫液在40℃下減壓蒸餾近干，加1ml40%甲基叔丁基醚甲醇溶液定容，過0.45μm濾膜后供hplc分析。
3.2、高效液相色譜儀參考條件
色譜柱：c184.6mm(i.d)×250mm，5μm；
梯度程序：流動相a:乙腈 流動相b:0.2%磷酸水溶液
功能
t(min)
a(%)
b(%)
0
18
88
12
1
2
100
0
0
10
100
0
1
0.1
88
12
0
9.9
88
12
流速：1ml/min；
柱溫：40℃波長：518nm；
進(jìn)樣體積:20μl
測定：取相同體積試樣制備液和標(biāo)準(zhǔn)使用液分別注入高效液相色譜儀，根據(jù)保留時間按定性，外標(biāo)峰面積法定量。
4、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4.1高效液相色譜圖
2.5μg/mli、ii、iv混合標(biāo)準(zhǔn)樣品
1、i2、ii3、iv
4.2工作曲線的繪制
i號工作曲線見下圖，線性相關(guān)系數(shù)：0.9997
5、 小結(jié)
實(shí)驗(yàn)中前處理步驟選用專用的萃取小柱，去油效果佳，能有效去除油酯等干擾，有較高的回收率和穩(wěn)定性；采用二元高壓梯度，三種組分有很好的分離效果和重復(fù)性。此方法也適用于其他食品基質(zhì)中的檢測。