atcc細(xì)胞采集及保存:
1. 血清:全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿:可用edta或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° c 1000 x g離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會影響后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
atcc細(xì)胞操作方法
(1)取成年新西蘭大白兔,耳緣靜脈注射空氣處死后,取下兔子的雙腿,立即用75%乙醇浸泡。
(2)移入細(xì)胞房內(nèi),去除雙腿表面的皮毛及肌肉,剪取關(guān)節(jié)段,移至超菌工作臺內(nèi)。
(3)pbs洗滌數(shù)次,用手術(shù)刀或彎剪將關(guān)節(jié)表面的軟骨組織取下。
(4)軟骨組織塊靜置5min,棄去上層液體及懸浮組織,將軟骨組織剪成1mm3的大小。移到離心管中加3倍體積的0.25%胰蛋白酶,置入37℃的恒溫?fù)u床中,振蕩消化15-20min;
(5) 4℃靜置5min;棄上清,pbs洗滌,去上清。加入0.2%膠原酶ii,置入37℃的恒溫?fù)u床中,振蕩消化2h;
(6)加入生長培養(yǎng)基終止消化,反復(fù)吹打后依次通過200目濾網(wǎng)。收集濾液,1200rpm離心8min,棄上清,用dmem*培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞, 放入37℃,5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
(7)細(xì)胞傳代后放入預(yù)置有薄骨片或蓋玻片的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞*展開后即可固定做原代鑒定。