食物中*(維生素H)的測定方法

發(fā)布時(shí)間:2025-05-21
微生物測定法
1.原理
*對(duì)于lactobacillus plantarum(atcc8014)的正常生長是一種必需的營養(yǎng)素,在一定生長條件下,lactobacillusplantarum的生長與繁殖速度與溶液中*的含量成一定的線性關(guān)系,通過利用濁度法或光密度法測定**生長和繁殖的強(qiáng)度可間接地測定出食物樣品中的*含量。*低檢出限為0.003ng。
2.適用范圍
本方法參考o(jì)fficial methods of analysis of the association of officialanalytical chemists、methods of vitamin analysis以及methods of themicrobiological analysis of selectednutrients。本方法適用于測定各類食物及飼料中的*含量。
3.試劑
本試驗(yàn)所用水均為蒸餾水,所用試劑均需分析純?cè)噭?br>3.1 甲苯。
3.2 1 mol/l硫酸溶液:在600ml水中加入55.6ml濃硫酸,稀釋至1000ml。
3.3 3 mol/l硫酸溶液:在600ml水中加入166.7ml濃硫酸,稀釋至1000ml。
3.4 10mol/l氫氧化鈉溶液:溶200g氫氧化鈉于水中,定容至500ml。
3.5 1:1(1+1)乙醇溶液:500ml無水乙醇與500ml水充分混勻。
3.6 酸解酪蛋白:稱取50g不含維生素的酪蛋白于500ml燒杯中,加200ml 3mol/l鹽酸,121℃高壓水解6小時(shí)。將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi),在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀,如此反復(fù)3次,以去除鹽酸。以溴酚藍(lán)作外指示劑,用10mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至3.5。加20g活性炭,振搖,過濾,如果濾液不呈淡黃色或無色,可用活性炭重復(fù)處理。濾液加水稀釋至500ml,貯存于試劑瓶中,加少許甲苯于4℃冰箱中保存。
?酸解的目的是為了消除酪蛋白中的維生素,確?;九囵B(yǎng)基中不含待測定的*,但有時(shí)酸水解不一定*,所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉(*好為sigma公司產(chǎn)品),這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含*。
3.7 *、*溶液:稱取4g l-*和1g l-*(或2gdl-*)于800ml水中,加熱至70~80℃,逐滴加入1:5(1+5)鹽酸,不斷攪拌,直至*溶解為止。冷至室溫,加水稀釋至1000ml。加少許甲苯于4℃冰箱中保存。
3.8腺嘌呤、*、*溶液:稱取硫酸腺嘌呤(純度為98%)、鹽酸*(生化試劑)以及*各0.1g于250ml燒杯中,加75ml水和2ml濃鹽酸,然后加熱使其*溶解,冷卻,若有沉淀產(chǎn)生,加鹽酸數(shù)滴,再加熱,如此反復(fù),直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止,以水稀釋至100ml,貯存于試劑瓶中,加少許甲苯于冰箱中保存。
3.9維生素溶液:稱取20mg核黃素,10mg鹽酸硫胺素,10mg對(duì)氨基苯甲酸,40mg鹽酸吡哆醇,用0.02mol/l乙酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.10鹽溶液:稱取10g mgso4 7h2o、1g kcl、0.5g mnso4 4h2o,0.5g feso4 7h2o加23ml 85% h3po4,用水溶解并定容至500ml。
3.11*標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液名稱濃度配置方法標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液50μg / ml稱取25mg無水*用(1+1)乙醇溶液定至500ml,于4℃冰箱中貯存。標(biāo)準(zhǔn)中間液ⅰ1μg / ml取5ml儲(chǔ)備液用(1+1)乙醇溶液定容至250ml,于2-4℃冰箱中貯存。標(biāo)準(zhǔn)中間液ⅱ10 ng / ml取5ml中間液ⅰ用(1+1)乙醇溶液定容500ml,于2-4℃冰箱中貯存標(biāo)準(zhǔn)工作液1 ng / ml取5ml中間液ⅱ用去離子水定容至50ml,在2-4℃冰箱中貯存。
3.12基本培養(yǎng)基:將下列試劑混合于500ml燒杯中,加水至200ml,以溴*藍(lán)作外指示劑,用10mol/l氫氧化鈉液調(diào)節(jié)ph至6.8,用水稀釋至250ml。
酸解酪蛋白 25ml
*、*溶液 25ml
腺嘌呤、*、*溶液 5ml
維生素溶液 5ml
鹽溶液 5ml
* 5g
無水醋酸鈉 5g
此培養(yǎng)基也可從difco公司購得,產(chǎn)品號(hào)為no.0419-15-8。
?由于國內(nèi)的某些試番茄汁,10ml吐溫-80,5.0~7.5g瓊脂,加熱溶解,用(2+3)氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph為6.5~6.8,然后定容至1000ml,分裝于試管,于121℃高壓**10分鐘,取出后豎直試管,待冷卻至室溫后于冰箱2-4℃保存。
3.13生理鹽水:稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中,。每次使用時(shí)分別倒入2~4支10ml試管中,每支約加10ml,塞好棉塞,于121℃高壓**10分鐘,備用。
3.14 0.4g/l溴*藍(lán)溶液:稱取0.1g溴*藍(lán)于小研缽內(nèi),加1.6ml 0.1mol/l氫氧化鈉研磨,加少許水繼續(xù)研磨,直至*溶解,用水稀釋至250ml。
3.15 0.4g/l溴甲酚綠溶液:稱取0.1g溴甲酚綠于小研缽中,加1.4ml 0.1mol/l氫氧化鈉研磨,加少許水繼續(xù)研磨,直至*溶解,用水稀釋至250ml。
3.16 1g/l溴酚藍(lán)乙醇溶液:稱取0.1g溴酚藍(lán),用乙醇溶解后,加乙醇稀釋至100ml。
3.17番茄汁:將新鮮番茄去皮、去籽后,制成勻漿,用紗布多次過濾,直至濾液呈淡黃色透明液體,滴加幾滴甲苯于液體表面,放置冰箱中冷凍保存。
4.儀器與設(shè)備
(1) 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備
(2) 電熱恒溫培養(yǎng)箱
(3) 壓力蒸汽**器
(4) 液體快速混合器
(5) 離心機(jī)
(6) 分光光度計(jì)
(7) 硬質(zhì)玻璃試管:20mm×150mm
5.菌種與培養(yǎng)液的制備與保存
5.1 儲(chǔ)備菌種的制備:lactobacillus plantarum(atcc8014)接種于直面瓊脂培養(yǎng)管中,在37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~24小時(shí),取出后放入冰箱中保存,每隔一周至少傳種一次。在實(shí)驗(yàn)前**必須傳種一次。
5.2 種子培養(yǎng)液的制備:加2ml*標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和3ml基本培養(yǎng)基于10ml離心管中,塞好棉塞,于121℃高壓**10分鐘,取出,冷卻后于冰箱中保存。每次制備兩管,備用。
? 加入離心管中的*標(biāo)準(zhǔn)液要適量,過少會(huì)影響lactobacillusplantarum的生長,過多會(huì)使零管中的光密度值增大,影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般2~3ml標(biāo)準(zhǔn)工作掖即可。
6.操作步驟
6.1 接種液的配制:使用前**,將已在瓊脂管中生長16~24小時(shí)的l.plantarum接種于種子培養(yǎng)液中,在37±0.5℃培養(yǎng)16~24小時(shí),取出后離心10分鐘(3000rpm),棄去上清液,用已**的生理鹽水淋洗2次,再加入3ml**生理鹽水,混勻后,將此液倒入已**的注射器中,立即使用。
? 菌種的淋洗一定要*,否則部分殘留在**表面的*會(huì)使空白管的光密度值升高,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
6.2樣品制備:稱取適量樣品,放入100ml三角瓶中,加50ml1mol/l硫酸(水解動(dòng)物樣品用3mol/l硫酸,水解植物樣品及混合型樣品用1mol/l硫酸),混勻后于121℃高壓水解90分鐘,取出冷卻至室溫。以溴甲酚綠為外指示劑,用10mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph為4.5,將水解液移至100ml容量瓶中,定容,過濾。樣品水解液只能在4℃冰箱保存2~3天。取適量水解液于25ml具塞刻度試管中,以溴*藍(lán)為外指示劑,用0.1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)至ph為6.8,用水稀釋至刻度。
6.3 樣品試管的制備:于平行樣品管中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液,加水至5ml,然后再加入5ml基本液體培養(yǎng)基。
6.4 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備:每組試管中分別加入*標(biāo)準(zhǔn)工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml,(相當(dāng)于0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ng)加水至5ml,再加入5ml基本液體培養(yǎng)基,需做三組標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.5 **:樣品管與標(biāo)準(zhǔn)系列管均用棉塞塞好,于121℃條件下高壓**10分鐘
? **時(shí)間不宜過長,否則會(huì)破壞基本培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分,影響lactobacillusplantarum的生長,*好在5-10分鐘內(nèi)。
6.6 接種與培養(yǎng):待試管冷至室溫后,每管接種一滴種子液,于37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~20小時(shí)。
?(1)接種前,接種室要在紫外燈下**至少30分鐘。(2)在接種時(shí),其中一支標(biāo)準(zhǔn)系列0管可不接種,這樣可觀察此次實(shí)驗(yàn)是否存在污染,并且可消除由于管中液體的顏色造成的誤差。
6.7 測定:分光光度計(jì),波長550nm條件下,以標(biāo)準(zhǔn)系列0管調(diào)零測定樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管的光密度值。
?首先以未接種的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行儀器調(diào)零,然后在用接種后的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行二次調(diào)零,之后再測定其他管中液體的光密度值。兩次調(diào)零的目的在于*消除液體本身的顏色及污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響.
7.計(jì)算
以*標(biāo)準(zhǔn)系列的不同納克數(shù)為橫坐標(biāo),光密度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在曲線上查出相對(duì)應(yīng)的樣品測定管中的*含量,然后再按以下公式計(jì)算樣品中*含量:
c·v·f
x= ---------------- ×100
m×1000
式中 x──樣品中*含量,μg/100g:
c──測定管中的*含量,ng:
v──樣品水解液的定容體積,ml:
f──樣品液的稀釋倍數(shù)
m──樣品質(zhì)量,g。
100/1000 ── 單位換算系數(shù)
8.注意事項(xiàng)
在實(shí)驗(yàn)過程中,一定要注意避免油脂的污染,因?yàn)楫?dāng)有油脂存在時(shí),會(huì)刺激lactobacillus plantarum(atcc8014)快速生長,導(dǎo)致其生長速度不再與*的含量呈線性關(guān)系。因此在實(shí)驗(yàn)前,要檢查所用玻璃器皿的表面是否已*清洗,操作者的雙手不要涂摸各種護(hù)手霜,以防此類油脂進(jìn)入被測液體中。
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