摘要本應(yīng)用方法介紹了一種簡單、快捷、廉價(jià)、有效、耐用、安全的(quechers) en 樣品制備方法及其應(yīng)用，該方法可用于菠菜中 13 種具代表性的不同種類殘留農(nóng)藥的萃取和凈化。菠菜被認(rèn)為是一種高色素基質(zhì)，而用于高色素瓜果和蔬菜的 en 分散固相萃取試劑盒是有選擇性的。試劑盒中將添加了 7.5 mg/ml 石墨化碳黑（gcb）的乙腈萃取劑。通過液相色譜和電噴離子化串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)用（lc-esi-ms/ms），正離子模式多重反應(yīng)監(jiān)測模式（mrm）測定菠菜萃取物中的殘留農(nóng)藥。通常認(rèn)為 gcb 對平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥萃取有顯著的負(fù)影響。但是，本文研究結(jié)果顯示在 en 分散固相萃取試劑盒中添加少量 gcb 時(shí)對平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的影響可以忽略，所得定量結(jié)果也是可以接受。本指南給出的菠菜中農(nóng)藥的定量限（loq）為 5 ng/g，大大低于最高允許殘留（mrl）?；厥赵囼?yàn)的加標(biāo)水平分別為 10、20、200 ng/g，表明回收率在 60%-99%范圍內(nèi)（平均 85.4%），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于11%（平均 5.5%）。
引言en quechers 方法被廣泛的用于食品中的農(nóng)藥分析，特別是在歐洲。該方法采用乙腈作萃取劑，然后通過利用氯化鈉和檸檬酸鹽緩沖液從樣品中的鹽析出水來誘導(dǎo)液-液分層。為了凈化的需要，采用了分散固相萃取步驟，結(jié)合乙二胺-n-丙基硅烷(psa)的使用以除去脂肪酸及其它組分，則用來吸收萃取物中的殘留水。根據(jù)不同的食物基質(zhì)，該步驟中可能會增加其它成分，如用于除去色素和甾醇的石墨化炭黑（gcb）或者用于除去更多類脂和脂肪油的 c18 等。由于含有高濃度的葉綠素，菠菜被認(rèn)為是一種高色素蔬菜。因此，本應(yīng)用選用適用于高色素量商品的 en 分散固相萃取試劑盒。在這些試劑盒中，除了 25 毫克 psa 和 150 毫克 mgso4 外，每毫升乙腈萃取劑中還加入了 7.5 毫克 gcb。gcb 可以吸附平面分子如色素和甾醇，因此它對于凈化色素基質(zhì)如菠菜是非常有幫助的。gcb 添加量越大，平面分子吸收得越多，可得到更干凈基質(zhì)的樣品。en 法和 aoac 法在凈化高色素基質(zhì)方面的主要區(qū)別是在分散固相萃取步驟中 gcb 添加量不同是。aoac 法中 gcb 的添加量較高（每毫升乙腈萃取劑中添加 5 毫克 gcb），en 法中 gcb的添加量較低 (處理“有色”產(chǎn)品時(shí)，每毫升乙腈萃取劑中添加2.5 毫克 gcb；處理“深色”產(chǎn)品時(shí)，每毫升乙腈萃取劑中添加7.5 毫克 gcb)。gcb 對平面農(nóng)藥萃取的影響隨所用方法的不同而有所區(qū)別。aoac 法可制得基質(zhì)更干凈的樣品，但是易造成平面農(nóng)藥分子的大量損失；與此相反，en 法造成的平面農(nóng)藥分子損失較少，但樣品基質(zhì)更為復(fù)雜。
之前，我們曾介紹過一種改進(jìn)的 aoac 法，即在分散固相萃取中添加甲苯可明顯提高高色素基質(zhì)（如菠菜）中平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的萃取效率[3]。隨后，我們采用原始 aoac 法（不含甲苯）和改進(jìn)的aoac 法（添加甲苯）相結(jié)合闡明了 bond elut quechers aoac試劑盒在菠菜中農(nóng)藥殘留分析方面的性能[4, 5]。在這項(xiàng)研究中，采用 13 種農(nóng)藥評價(jià)了安捷倫 en 緩沖萃取劑(部件號 5982 - 5650)和bond elut quechers en 分散固相萃取試劑盒在高色素水果和蔬菜(部件號 5982-5321 和 5982-5356)分析中的性能。也驗(yàn)證了該方法的重現(xiàn)性和回收率也。表 1 是菠菜中各種農(nóng)藥的化學(xué)和法規(guī)信息。
實(shí)驗(yàn)部分藥品和試劑所用試劑和溶劑均為高效液相純級或分析純級。甲醇和甲苯購自霍尼韋爾（美國，馬斯基根）。乙腈(acn)、二甲基亞砜(dmso)、冰醋酸(hac)購自 sigma- aldrich 公司（美國，密蘇里州圣路易斯）。醋酸銨(nh4oac)購自費(fèi)舍爾化工(美國，新澤西，fair lawn)。甲酸(fa)購自 fluka(德國，sleinheim)。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物（磷酸三苯酯，tpp）分別購自 sigma- aldrich 公司（美國密蘇里州圣路易斯）、chem service 公司（美國賓夕法尼亞州西切斯特）、ultra scientific 公司（美國羅得島州北金斯敦）或 alfaaesar (美國，馬薩諸塞州，ward hill)。溶液及標(biāo)準(zhǔn)品將 19.27 克 nh4oac 粉末溶解在 250 mlmilli-q 超純水中，用 ph計(jì)監(jiān)控，采用乙酸調(diào)溶液 ph 值到 5，得到 ph=5 的 1m 醋酸銨原液，并于 4 oc 保存。將 200ml meoh 與 800ml milli-q 超純水混合，加入 5ml ph=5 的 1m 醋酸銨原液，混合均勻，得到meoh/h2o=20：80、ph=5 的 5 mm 醋酸銨溶液。向 1l 乙腈中加入 5mlph=5 的 1 m 醋酸銨原液，均勻混合后超聲 5 min，即得5 mm 醋酸銨乙腈溶液。1%甲酸的乙腈溶液可通過 100 ml 乙腈與1 ml 甲酸混合均勻得到。標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物（is）儲備液(除多菌靈為 0.5 mg/ ml 外，其余均為 2.0 mg/ ml)分別用 meoh，含 0.1 %甲酸溶液的乙腈或 dmso配制，于-20 oc 下低溫儲存。1、5、20 µg/ml 的三種 qc 加標(biāo)溶液以乙腈和 0.1%甲酸溶液的水 1:1 混合作基質(zhì)，現(xiàn)配現(xiàn)用。制備10 µg/ml 標(biāo)準(zhǔn)品的乙腈/水（含 0.1% fa）=1:1 的加標(biāo)溶液，并通過適當(dāng)稀釋，用于獲得空白基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以含 0.1%甲酸溶液的 1:1 乙腈/h2o 為溶劑，制備 15 µg/ml 的 tpp 加標(biāo)溶液。
儀器和材料agilent 1200 series hplc with diode array detector (agilenttechnologies inc., ca, usa)配備二極管陣列檢測器的 agilent 1200 系列高效液相色譜系統(tǒng)（美國，加州，安捷倫科技有限公司）配置電噴霧離子源的 agilent 6410 三重串聯(lián)四級桿 lc / ms 系統(tǒng)（美國，加州，安捷倫科技有限公司）agilent bond elut quechers en 萃取試劑盒，部件號 5982-5650和用于高色素水果和蔬菜的 bond elut quechers en 分散固相萃取試劑盒，部件號 5982 - 5321 和 5982- 5356（安捷倫科技有限公司，德州，美國)centracl3r 離心機(jī)（美國馬薩諸塞州 thermo iec）瓶口移液器（美國新澤西州，so painfield，vwr）eppendorf 微型離心機(jī)（美國紐約，westbury，brinkmann 儀器公司）
儀器條件lc/ms/ms 法如前所述[9]液相色譜條件色譜柱： agilent zorbax 溶劑節(jié)省 plus eclipse plus苯基-己基柱，3.0 x 150 mm, 3.5 µm（部件號 959963-312)流速： 0.3 ml/min柱溫： 30 oc進(jìn)樣量： 10 µl流動(dòng)相： a, ph=5 的 5 mm 乙酸銨 meoh/h2o=20:80 溶液；b, ph=5 的 5mm 乙酸銨乙腈溶液洗針液： 1:1:1:1 乙腈/甲醇/異丙醇/水含 0.2%甲酸梯度： 流速時(shí)間 % 乙腈 (ml/min)0 20 0.30.5 20 0.38.0 100 0.310.0 100 0.313.0 停止后運(yùn)行： 4 分鐘總分析時(shí)間： 17 分鐘質(zhì)譜條件正離子模式氣體溫度： 350 oc氣體流速： 10 升/分霧化氣： 40 psi毛細(xì)管電壓： 4000v分析物相關(guān)的其他條件列于表 2。
樣品制備樣品制備過程包括樣品粉碎，萃取/分離和分散固相萃取凈化等步驟，這在早期的應(yīng)用指南上有詳細(xì)的描述。[9]菠菜樣品處理過程與蘋果樣品處理過程很相似，但與一般的水果和蔬菜樣品處理相比，菠菜樣品處理的分散固相萃試劑盒適用于高色素量產(chǎn)品分析。簡單來說，首先將凍存的有機(jī)菠菜勻漿。取 10 克（±0.1 克）勻漿后的樣品放入 50 毫升離心管中。如需要，可先通過適當(dāng)?shù)膓c 加標(biāo)溶液(100 µl)對樣品進(jìn)行加標(biāo)，然后加入 66.7 µl is 加標(biāo)溶液（15 µg/ml 的 tpp）。渦旋 30 秒，每個(gè)樣品管中加 10 ml 乙腈，蓋緊樣品管蓋，振搖 1 分鐘。每一個(gè)離心管中直接加入agilent bond elut quechers en 萃取鹽包(部件號 5982-5650)、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉，0.5 g 檸檬酸氫鈉半水合物。蓋好管，用力振搖 1 分鐘，于 4000 rpm 離心 5 分鐘。1 ml 上層乙腈層轉(zhuǎn)入安捷倫分散型固相萃取柱的 2 ml 管中（部件號 5982-5321）；或 6 ml 上清液轉(zhuǎn)入安捷倫分散型固相萃取柱的 15 ml 管中（部件號 5982-5356 ）。2 ml 的管中含有 25 mgpsa， 7.5 mg gcb，而 15 ml 管中則含有150 mg psa， 45 mg gcb。蓋緊管，用力搖 1 分鐘。將 2 ml 管 放入微 型離心 機(jī)中 13000 rpm 離心2 min，15 ml 管在標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)以 4000 rpm 離心 5 min。取 200 µl等份的萃取液轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中，立即加入 10 µl 1% 甲酸的乙腈溶液。然后加入 800 µl 水或者適量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（制備成水溶液）。蓋緊樣品管，渦旋混勻，以備 lc/ms/ms 分
結(jié)果與討論quechers 方法為農(nóng)藥殘留分析提供了獲得高質(zhì)量結(jié)果的快速、簡便而廉價(jià)的方法。對于含色素的水果和蔬菜，在分散型固相萃取管中添加石墨化碳黑（gcb）可以提高色素和甾醇的清除效率。清除效率與 gcb 的加入量有關(guān)。添加 gcb 的量越多，處理后的基質(zhì)就會越干凈，最終樣品中的基質(zhì)干擾就越少。由于 gcb 也可能導(dǎo)致萃取過程中的平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥分子的清除，所以在 en 分散固相萃取步驟中使用了非常少量的 gcb。與 aoac 方法相比，用于色素性物質(zhì)的 en 方法在分散固相萃取步驟中使用了非常少量的 gcb。對于像胡蘿卜、生菜這樣的普通色素性商品，每毫升乙腈萃取劑中添加 2.5 mg 的 gcb；對于高色素性商品如菠菜和紅甜椒，每毫升乙腈萃取劑中則需要添加 7.5 mg 的 gcb。[1]根據(jù)建議，我們研究中采用適用于高色素產(chǎn)品的 en 分散萃取試劑盒。由于采用高色素試劑盒，en 方法中的 gcb 用量仍然比aoac 方法低得多，每 ml 乙腈萃取劑中只需添加 50 mg gcb。所以，很明顯，en 方法中的基質(zhì)凈化效率要比 aoac 法弱得多。通過 en 方法處理得到的樣品仍然呈現(xiàn)深綠色，而先前經(jīng)過aoac 法處理后的樣品幾乎呈無色透明狀。空白基質(zhì)的紫外色譜（l= 254 nm）也有差異，如圖 1 所示。en 法處理的空白基質(zhì)中干擾峰更多，而且更多的雜質(zhì)在色譜柱或離子源處累積，可能對色譜柱及質(zhì)譜儀造成不利影響。然而，由于 lc/ms/ms 提供了選擇性，空白基質(zhì)的 mrm 色譜圖并沒有顯示任何目標(biāo)分析物的干擾峰。圖 2 顯示了空白基質(zhì)（添加內(nèi)標(biāo)物）和 50 ng/g 經(jīng)過 en 分散萃取法處理的加標(biāo)菠菜萃取物的 lc/ms/ms 色譜圖。4 種農(nóng)藥包括多菌靈、噻菌靈、嘧菌環(huán)胺和吡蚜酮，由于具有平面結(jié)構(gòu)，在經(jīng)過原來的 aoac 分散固相萃取方法處理時(shí)明顯損失。而在固相萃取步驟中，添加甲苯改進(jìn)該方法可以提高萃取效率[3,4]。為了研究 gcb 對于平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥的影響，我們比較了固相萃取步驟中分別添加和不添加甲苯時(shí)，對相同農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（50ng/g）水平加標(biāo)的菠菜樣品萃取效果。結(jié)果表明，在 en 法中g(shù)cb 的使用量比較少時(shí)，平面農(nóng)藥很少或沒有損失，加入甲苯?jīng)]有明顯改善。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用了原始的 en 方法。也考察了該方法的回收率和重現(xiàn)性，還對定量結(jié)果進(jìn)行了討論。
關(guān)鍵詞：質(zhì)譜儀 移液器 色譜柱 離心機(jī) 微型離心機(jī)