通過 sfc-uv/ms 分離西紅花主要提取物
?西紅花，又稱藏紅花，是世界上昂貴的香料之一，其花朵呈現一種精致的紫色色調，內部的絲狀紅色柱頭非常珍貴。在秋天，紅色柱頭通過手工采摘并分離，生產一磅(0.45公斤)的西紅花柱頭需要7萬朵花。這些紅色柱頭可以用作香料、染料并且具有藥用價值。
▲圖1：西紅花花朵與柱頭
西紅花內有非常多的提取物，主要成分為西紅花苷、苦番紅花素、西紅花酸等。其中許多化合物有被廣泛認同的藥理活性， 比如西紅花苷在治療心血管疾病方面具有一定的作用。
西紅花苷存在于西紅花及梔子屬植物中，比較常見的分離法是采用高壓液相色譜法（hplc），c-18色譜柱，流動相為水/乙腈或水/甲醇體系。初始梯度為高含水量，有機溶劑含量隨時間而增加，以洗脫非極性化合物，分離過程中也會加入甲酸以改善峰型。[2-6]
梔子類藥材中西紅花苷類成分的定性定量分析：
▲圖2：a.混合對照品；b.梔子；c.水梔子的 hplc 分離圖
西紅花苷ⅰ 5. 西紅花苷ⅱ 8. 西紅花苷ⅳ 17. 西紅花苷ⅲ
acchrom xcharge c18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈（a）和0.1%甲酸水溶液（b），梯度洗脫，洗脫程序為：0～15min，22% a；15～30min，22%～25% a；30～35min，25%～28% a；35～50min，28% a；50～72min，28%～45% a；72～85min，45%～55% a；流速1ml·min-1，柱溫30℃，檢測波長440 nm，進樣體積10μl。
本文介紹了一種利用buchi sepiatec sfc-50分離西紅花柱頭主要提取物的方法。sfc-50內置紫外檢測器并與ms（質譜檢測器）相連，從而判斷峰物質。
▲圖3：sepiatec sfc-uv/ms系統(tǒng)
1 實驗條件
設備
sepiatec sfc-50(uv/ms)
色譜柱
nucleodur nh2 5μm 250 x 4 mm
流動相種類
a=co2 ;b=甲醇
流動相條件
平衡色譜柱5分鐘
0-1 min: 14 % b
1-18 min: 14-18 % b
18-40 min: 18-50 % b
40-44 min: 50 % b
流速
7 ml/min
紫外檢測器
440 nm
mass 檢測器
esi (+/-)
背壓
150 bar
柱溫
40 ℃
樣品
1000mg 西紅花柱頭 10ml 熱甲醇提取物
進樣量
100 ul
2 結果與討論
▲圖4：西紅花提取物在紫外波長440nm下的分離圖
用甲醇對西紅花柱頭的主要成分進行了提取后，得到的多數為極性化合物。圖4為紫外波長 440nm 下的分離圖。在前18分鐘，由于流動相為弱極性(86- 82% co2)，紫外檢測器下無化合物被洗脫下來。當流動相的極性通過梯度增加時，幾種極性化合物被依次洗脫。其中的主要提取物西紅花酸易與幾種糖(葡萄糖、龍膽二糖和三氯蔗糖)結合形成西紅花苷。因為西紅花酸與糖分子的共價鍵導致了極性的強烈增加，并使西紅花苷具有親水性，所以在氨基柱上的分離出峰時間比較晚[7-9]。
在質譜檢測上，我們使用電噴霧離子源（esi），這是一種常壓下的溫和電離方法，可以在正離子(esi+)或負離子(esi-)下進行。在正離子模式下，通常會形成鈉加合物([m+na]+)或質子加合物([m+h]+)。在負離子模式下，([m-h]-)離子通常是由于失去一個質子而形成的。根據樣品及其性質的不同，也可以形成多種帶電產物。
▲圖5：(a) uv-440 nm;(b) mass 999-999.5 (esi+);(c) mass 836.9-837.4 (esi+);(d) mass 674.8-675.3 (esi+);(e) mass 975.5- 976 (esi-);(f) mass 813.4-813.9 (esi-);(g) mass 651.4-651.9 (esi-);(h) mass 341.2-341.7 (esi-)
▲圖6：西紅花苷ⅰ(a) esi+ and (b) esi-, 西紅花苷ⅱ(c) esi+ and (d) esi-, 西紅花苷ⅲ (e) esi+ and (f) esi- 以及西紅花酸單甲酯(g)esi-的質譜圖
圖5與圖6展示了西紅花甲醇提取物通過 sepiatec sfc-50 結合 ms 檢測器后的分離圖譜，信號基于不同的 m/z（質子數/電荷數）。根據質譜結果我們可以推斷出表1的結構式結果。
no.
化合物名稱
結構式
m/z
1
西紅花苷ⅰ
976.4
c44h64o24
2
西紅花苷ⅱ
814.8
c38h54o19
3
西紅花苷ⅲ
652.7
c32h44o14
4
西紅花酸單甲酯
342.4
c21h26o4
▲表1：根據圖5推斷的西紅花主要提取物的結構式和摩爾m/z
西紅花苷ⅰ是由西紅花酸和兩個龍膽二糖分子組成。在圖5中，該化合物 esi+ 模式下的檢測 m/z 為 999-999.5，其加合物由鈉(m/z 23 g/mol)和樣品分子(m/z 976.4 g/mol)組成。在 esi- 模式下也可以檢測到西紅花苷ⅰm/z 為975.5-976。其對應的圖6質譜圖為(a)與(b)。
西紅花苷ⅱ由西紅花酸、葡萄糖和龍膽二糖分子組成。在 esi+ 模式(圖5(c))和 esi- 模式(圖5(f))下，分別為(m/z 836.9-837.4[m+na]+)和(m/z 813.4-813.9[m- h]-)。其對應的圖6質譜圖為(c)與(d)。
西紅花苷ⅲ在 esi+ 模式(圖5(d))和 esi- 模式(圖5(g))下，分別為(m/z 674.8-675.3[m+na]+)和(m/z 651.4-651.9[m-h]-)。其對應的圖6質譜圖為(e)與(f)。
西紅花酸單甲酯只能在 esi- 模式(圖5(h))下鑒別，m/z為341.2-341.7[m-h]-。其對應的圖6質譜圖為(g)。
在 esi 過程中，樣品分子會被碎片化，特別是在 esi- 模式中。例如，西紅花苷ⅰ和西紅花苷ⅱ上的葡萄糖基團在esi-模式下的脫離，導致其在圖5(g) m/z 651.4-651.9[m-h]- 中也被鑒定出來。
3 結論
sepiatec sfc-50 可以有效分離西紅花柱頭內結構相似的提取物，為了鑒別里面的未知成分，采用 sfc-uv/ms 結合的形式，適用于多數天然產物應用。相比 hplc 的流動相，超臨界二氧化碳具有高擴散系數和低粘度的特點，并且得益于二氧化碳的弱酸性，無需加入甲酸也能獲得不錯的峰型。在選擇性上，由于 sfc 屬于正相色譜，在出峰順序和時間上與傳統(tǒng)的 rp-lc 不同，這使得 sfc 在分離一些化合物組分時具備出峰時間上的優(yōu)勢。比如本次分離中的西紅花苷ⅲ，在圖2的 rp-lc 中，出峰順序靠后，時間在 60 分鐘之后；而在圖5的 sfc 中，其出峰順序靠前，時間在 28-29 分鐘。這在分離一些極性偏弱的化合物時可以節(jié)省很多時間。
4 參考
doi: 10.13140/rg.2.2.19634.40649
dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.06.090
doi: 10.1081/fri-100100281
doi: 10.1016/j.foodchem.2005.11.020
doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113094
葉瀟，張東，馮偉紅，梁曜華，劉曉謙，李春，王智民．梔子類藥材中西紅花苷類成分的定性定量分析[j/ol]．中國中藥雜志.
doi.org/10.19540/j.cnki.cjcmm.20220214.301
doi.org/10.1021/acs.jafc.5b03194
doi.org/10.1073/pnas.140462911
doi: 10.1007/s00425-004-1299-1