尿嘧啶特異性切除試劑（uracil-specific excision reagent , user）是由尿嘧啶dna糖基化酶（uracil dna glycosylase,udg）和核酸內(nèi)切酶ⅷ(endonuclease viii, endo ⅷ)（戳鏈接了解詳情）兩種酶混合而成。udg識別ssdna或dsdna上的du堿基并形成ap位點(diǎn)，但磷酸二酯骨架結(jié)構(gòu)保持完整。endo viii的裂解酶活性能夠使ap位點(diǎn)的3′和5′端的磷酸二酯鍵斷裂，釋放無堿基的脫氧核糖，形成單核苷酸間隙。因此，user酶混合物能在dna的du位置產(chǎn)生一個單核苷酸缺口，適用于ssdna、dsdna及環(huán)狀dna，可應(yīng)用于
rna鏈特異性文庫構(gòu)建；
尿嘧啶特異性刪除介導(dǎo)的克?。╱ser-lic）；
tale基本單位的組裝；
單細(xì)胞多個cdna串聯(lián)建庫。
圖1. 切除dutp示意圖
uracil-specific excision reagent的應(yīng)用
01rna鏈特異性文庫構(gòu)建
rna測序（rna-seq）已成為全轉(zhuǎn)錄組水平研究差異基因表達(dá)和mrna差異剪接的工具，具有更準(zhǔn)確、可重復(fù)、廣泛和可靠的特點(diǎn)。rna-seq的基本流程包括：提取rna、建立cdna文庫、上機(jī)擴(kuò)增測序、數(shù)據(jù)分析。其中rna-seq文庫構(gòu)建包括常規(guī)建庫和rna鏈特異性建庫兩種方法。在常規(guī)mrn建庫的流程中，由于我們在雙鏈cdna的兩端加上的接頭是對稱的，這樣得到的文庫在測序后，無法判斷測出來的reads是來自正鏈還是負(fù)鏈。為了避免普通rna-seq無法區(qū)分轉(zhuǎn)錄本方向的問題，后來出現(xiàn)了鏈特異的文庫構(gòu)建方法。鏈特異性rna-seq保留了轉(zhuǎn)錄本的方向信息，可以確定reads是來源于正鏈或負(fù)鏈，使得基因定量和可變剪切事件檢測更準(zhǔn)確。如圖2所示，利用dutp標(biāo)記cdna二鏈，user酶混合物使標(biāo)記鏈被降解，可以實(shí)現(xiàn)鏈特異性rna-seq文庫構(gòu)建。
技術(shù)路線：
01使用引物合成rna對應(yīng)的cdna第一鏈；
02使用dutp取代dttp合成cdna的第二條鏈；
03末端修復(fù)、3’加a、接頭連接；
04去除含dutp的cdna鏈：用user酶混合物處理，將含有dutp的cdna鏈去除，留下cdna一條反鏈；
05pcr 擴(kuò)增，上機(jī)測序。
圖2.常規(guī)rna建庫與鏈特異性文庫構(gòu)建對比[1]
02尿嘧啶特異性刪除介導(dǎo)的克?。╱ser-lic）
user-lic是一種不依賴限制酶切位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)無痕克隆以及多片段同時組裝的新型體外重組克隆。user-lic主要是通過user酶混合物特異性識別和刪除擴(kuò)增的雙鏈dna片段中的dutp，從而實(shí)現(xiàn)重疊dna序列長度的可控。
技術(shù)路線：
01擴(kuò)增：用含dutp的引物擴(kuò)增目的片段和載體；
02切除dutp：將得到的兩種線性片段用user酶混合物處理，使它們暴露互補(bǔ)的粘性末端；
03連接與轉(zhuǎn)化：將帶有互補(bǔ)粘性末端的兩種線性片段混合后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過篩選獲得目標(biāo)質(zhì)粒。
圖3.克隆示意圖[2]
03助力tale技術(shù)，構(gòu)建tale基本單位
tale技術(shù)（transcription activator-like effector , tale）是一種熱門的基因編輯工具，能夠精準(zhǔn)編輯dna。tale的基本單位是一個可以識別不同堿基的蛋白domain，一個domain可以識別一個堿基，所以要構(gòu)建一個識別多個連續(xù)dna堿基的tale就需要多個對應(yīng)的基本蛋白domain。使用user-lic的方法，可以高效地合成這些基本單元，然后將它們有序組裝成最終的tale工具。這種技術(shù)在低脫靶率等方面具有優(yōu)勢，被廣泛用于各種基因編輯工具的開發(fā)。
技術(shù)路線：
01擴(kuò)增：使用含有dutp的引物擴(kuò)增每個特定的tale基本單位的編碼基因；
02切除dutp：使用user酶混合物切除dutp，在每個基本單位的編碼基因dna兩端保留一段特定的粘性末端；
03組裝：這些粘性末端按照預(yù)先設(shè)計的順序排列，以確保所有基本單位按順序組裝連接成最終靶向特定序列的tale工具。
圖4.基于尿嘧啶切除克隆的tale組裝示意圖[3]
04助力hit-scisoseq技術(shù)，將單細(xì)胞多個cdna串聯(lián)建庫
hit-scisoseq技術(shù)由華大基因唐沖博士團(tuán)隊和中山大學(xué)眼科中心眼科國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉奕志院長團(tuán)隊共同開發(fā)，該技術(shù)利用user酶混合物在cdna兩個末端產(chǎn)生粘性末端，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞多個cdna串聯(lián)建庫，結(jié)合pacbio平臺（ccs）測序，以實(shí)現(xiàn)高通量和高精度的單細(xì)胞rna亞型測序研究。
技術(shù)路線：
01獲得單細(xì)胞cdna：借助10x genomics 平臺，獲得單細(xì)胞全長cdna；
02擴(kuò)增cdna：利用生物素化的含dutp的pcr引物對全長cdna進(jìn)行擴(kuò)增；
03捕獲cdna：然后使用鏈霉親和素珠捕獲擴(kuò)增的生物素化的cdna；
04切除dutp：使用user酶混合物切除dutp，在cdna的兩個末端產(chǎn)生粘性末端；
05連接與測序：使用dna連接酶連接多個cdna構(gòu)建ccs文庫后進(jìn)行長讀長測序。
圖5.hit-scisoseq單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的技術(shù)流程[4]
翌圣uracil-specific excision reagent
翌圣uracil-specific excision reagent（cat#14537es）由翌圣生物分子酶改造平臺———zymeeditor™經(jīng)過重組表達(dá)獲得的endo viii（cat#14536es）與udg（cat#14455es）的混合酶，無核酸酶、rnase殘留，低宿主殘留，適用于dutp切除、user-lic、rna鏈特異性建庫以及單細(xì)胞cdna串聯(lián)建庫等領(lǐng)域。
數(shù)據(jù)展示
01dutp切除效果與進(jìn)口品牌n*一致
分別使用翌圣的uracil-specific excision reagent（1 u/μl）與進(jìn)口品牌n*的同類產(chǎn)品（1 u/μl）切除10 pmol含dutp的雙鏈dna，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，翌圣uracil-specific excision reagent與進(jìn)口品牌n*的切除效果一致。
圖6. dutp切除效果對比圖
02user-lic效果優(yōu)于進(jìn)口品牌n*
分別使用翌圣的uracil-specific excision reagent（1 u/μl）和進(jìn)口品牌n*的同類產(chǎn)品（1 u/μl）連接600bp dna片段構(gòu)建載體，并導(dǎo)入到大腸桿菌中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)，結(jié)果表明，翌圣uracil-specific excision reagent應(yīng)用于user-lic效果優(yōu)于進(jìn)口品牌n*。
圖7.菌落數(shù)對比
客戶反饋
rna鏈特異性建庫性能與進(jìn)口品牌n*一致客戶測試翌圣14537es與進(jìn)口品牌n*的rna鏈特異性建庫性能，擴(kuò)增曲線表明翌圣uracil-specific excision reagent與進(jìn)口品牌n*的rna鏈特異性建庫性能一致。
圖8.qpcr擴(kuò)增曲線
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參考文獻(xiàn)
[1]zhaos,zhangy,gordonw,etal.comparisonofstrandedandnon-strandedrna-seqtranscriptomeprofilingandinvestigationofgeneoverlap.bmcgenomics.2015sep3;16(1):675.doi:10.1186/s12864-015-1876-7.[2]annalurun,mullerh,ramalingams,kandavelouk,londonv,richardsonsm,dymondjs,cooperem,baderjs,boekejd,chandrasegarans.assemblingdnafragmentsbyuserfusion.methodsmolbiol.2012;852:77-95.doi:10.1007/978-1-61779-564-0_7.pmid:22328427.[3]zhouj,wangj,chenf,zhuangz,chenm,yangy,luox,tangc,zhoux,chiy,wangj,hey,zhangk,zouq.improvedusercloningfortaleassemblyanditsapplicationtobaseediting.plosone.2023aug4;18(8):e0289509.doi:10.1371/journal.pone.0289509.[4]shi,zx.,chen,zc.,zhong,jy.etal.high-throughputandhigh-accuracysingle-cellrnaisoformanalysisusingpacbiocircularconsensussequencing.natcommun14,2631(2023).