這篇綜述重點說明使用 ripa 裂解液提取總蛋白以及下游實驗中可能存在的問題。
ripa 裂解液常用于從脊椎動物細(xì)胞和組織中提取總蛋白 [1]。但是由于蛋白質(zhì)間有較大的差異和非蛋白成份的干擾，所以從一個樣本中同時釋放和溶解所有蛋白質(zhì)是非常困難的。特別是一些整合到膜上的蛋白質(zhì)，或與其他蛋白質(zhì) / 核酸形成復(fù)合物時，就大大阻礙了提取效率。因此可以推斷，蛋白質(zhì)在提取過程中或多或少的與在體內(nèi)時情況不盡相同。
經(jīng)典 ripa 裂解液中含有低濃度的十二烷基硫酸鈉（sds 變性劑），脫氧膽酸（干擾蛋白質(zhì)間相互作用）及其他成分。雖然 ripa 裂解液經(jīng)過不斷改良使用，但是 ripa 提取蛋白通常會產(chǎn)生兩個不同的部分：即 ripa 可溶組分和 ripa 不可溶組分。 一般來說，只有 ripa 可溶組分被用于下游實驗，而 ripa 不可溶組分被丟棄。這樣提取的蛋白在使用中會存在哪些問題呢？
先來看些文獻(xiàn)數(shù)據(jù)：
研究發(fā)現(xiàn)，不同的蛋白在 ripa 裂解液中溶解性不同，例如 f9 中的纖維連接蛋白不溶于 ripa 裂解液 [2] 。而小鼠額葉樣品中在 ripa 可溶組分和非可溶性組分中含有相同量的 septin 7 [3]（下圖），表明用 ripa 裂解液提取這些特定蛋白質(zhì)的效率十分低。
近年來，越來越多的研究者密切關(guān)注 ripa 不可溶組分中的蛋白質(zhì)組分，以及它們對下游實驗和整體數(shù)據(jù)的影響。bai 和 laiho 用 ripa 裂解液從 hela 細(xì)胞核中提取蛋白，發(fā)現(xiàn)可溶性組分和不可溶性組。
分的蛋白質(zhì)圖譜差異很大，表明蛋白質(zhì)的丟失不成正比[4] （下圖）。
mukhopadhyay 等 [5] 從突變小鼠的乳腺上皮細(xì)胞中提取總蛋白，發(fā)現(xiàn)在 ripa 不可溶組分中，通過 wb 很容易檢測到 egfr, hsp90, c-src, 和 tubulin，表明這些蛋白在 ripa 不可溶組分中大量存在（下圖）。
wang 等 [6] 對比 sds 加熱法和 ripa 裂解液法從斑馬魚肝臟腫瘤中提取蛋白，發(fā)現(xiàn) ripa 裂解液提取這些樣品時對于大分子量蛋白的提取效率十分低（下圖）。
li[7] 對比了從小鼠脾臟和肝臟中提取總蛋白 ripa 可溶和不可溶性組分以及基于離心管柱法商業(yè)試劑盒提取的蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn) ripa 不可溶組分蛋白質(zhì)圖譜與可溶性組分圖譜相似，但是不*相同。這些丟失的不可溶組分覆蓋了整個蛋白質(zhì)圖譜分子量范圍，不同樣品的不可溶組分也有細(xì)節(jié)上的差異。不同樣品的蛋白質(zhì)丟失是不可預(yù)測的。然而，商業(yè)試劑盒提取蛋白不產(chǎn)生不可溶組分，更快速，可獲得更高產(chǎn)量更完整的蛋白質(zhì)圖譜（下圖）。
ngoka [8] 用質(zhì)譜平行對比了幾組乳腺癌 ripa 可溶組分和不可溶組分的蛋白質(zhì)圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用含尿素的裂解液提取 ripa 不溶性組分中的平均分子量蛋白質(zhì)含量比可溶性組分高 60% 。換句話說，許多大分子量蛋白質(zhì)被丟失在 ripa 不可溶組分中。研究還表明，幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)（ecm）和許多細(xì)胞骨架蛋白被發(fā)現(xiàn)在 ripa 不可溶組分里。這些結(jié)果表明，由于蛋白丟失在不可溶組分中產(chǎn)生了偏差, ripa 提取蛋白的蛋白質(zhì)譜是不*的。
利用 ripa 裂解細(xì)胞后一個主要用途是進(jìn)行目標(biāo)蛋白的定性和 / 或定量分析[9,10,11]。zui近一篇綜述報道了影響定量免疫印跡的關(guān)鍵因素 [12]，在這項研究中，tubulin, lamin a, krt5 顯示大量丟失在 ripa 不可溶組分中。zui值得注意的是，組蛋白 h3k4me2 發(fā)現(xiàn)僅僅存在于 ripa 不可溶組分中。轉(zhuǎn)錄因子 gata-2 和黏附分子β-catenin 也出現(xiàn)在不可溶組分中。研究中的另一個重要發(fā)現(xiàn)是樣品制備方法對實驗結(jié)果有顯著影響。janes [12] 對比了 np-40，ripa 裂解液和 laemmli 裂解液的作用，用 wb 檢測切割形式的 caspase-8，發(fā)現(xiàn)使用 laemmli 裂解液的樣品中可以檢測到，而使用 ripa 裂解液樣品中沒有檢測到，證實了 ripa 裂解液不適合用于這類型的分析。
利用 ripa 裂解液提取的蛋白還被發(fā)現(xiàn)會人為的增加了某些蛋白激酶的活性。用 ripa 裂解液裂解結(jié)腸癌細(xì)胞比用 np-40 裂解后體外蛋白酶活性升高了 5-7 倍 [13]。zapata[14] 等人，對比用 ripa 和 2%sds 提取活化的 t 淋巴細(xì)胞 caspase 的活性，發(fā)現(xiàn) ripa 裂解液通過釋放 grab 人工激活 caspase-3。這些結(jié)果強(qiáng)烈建議大家在使用 ripa 裂解液時要做好應(yīng)對數(shù)據(jù)解讀的預(yù)案。
如上所述，使用 ripa 裂解液提取總蛋白由于蛋白的丟失會產(chǎn)生很多問題。
就總蛋白而言，提取過程中
(1) 丟失的蛋白會引起蛋白圖譜的變化
(2) 改變不同種類蛋白的比例
(3) 改變某些蛋白的活性。
下游實驗中可能存在的問題：
（1） 使用 ripa 裂解液提取蛋白做 wb 會人為的增強(qiáng)或降低某些信號強(qiáng)度。ripa 裂解液提取蛋白已經(jīng)被證實有 10-30% 的蛋白會丟失在不可溶組分中 [12]。
（2） 如果一個細(xì)胞 / 組織樣品中某些特定的蛋白質(zhì)可以在可溶組分和不可溶組分間轉(zhuǎn)變，或者像上面所述受激活狀態(tài)影響 [12] 的情況下，數(shù)據(jù)的解釋可能成為一個大問題。
（3） ripa 裂解液提取的蛋白不適合用于目標(biāo)蛋白的定性和 / 或定量分析。
理想的總蛋白提取應(yīng)該是什么樣的呢？
（1） 獲取給定樣品中完整的蛋白質(zhì)圖譜，要真實的反映所有蛋白質(zhì)種類和比例。大多數(shù)研究人員認(rèn)為他們采用的總蛋白提取方法已經(jīng)反映了體內(nèi)目前的情況，但是很少有人真正的通過平行實驗對比不同的提取方法。在許多情況下，很可能真實的蛋白質(zhì)圖譜和研究者相信的結(jié)果不*相同。
（2） 獲取zui大的蛋白質(zhì)溶解度，zui少的蛋白質(zhì)損失以及得到完整的蛋白質(zhì)圖譜才是蛋白質(zhì)提取zuijia的選擇。