一般來說，細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移，最，佳的策略是進(jìn)行低溫保存（-70℃~-196℃），而細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在-70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于完，全停止?fàn)顟B(tài)，故而可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程，在此溫度范圍內(nèi)，冰晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。
經(jīng)過前人的長(zhǎng)期試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇基本原則是慢凍速融，這樣可以最，大限度的保存細(xì)胞活力。
材料準(zhǔn)備
1、儀器：凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。
2、玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。
3、塑料器皿：吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1~2ml）。
4、其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、醫(yī)，用，橡，皮膏、移液槍。
5.pbs,胎牛血清，dmso，培養(yǎng)液，雙抗，胰，蛋白酶（0.25%）。
細(xì)胞凍存
目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由冰晶形成的細(xì)胞損傷。
1、10%的dmso+90%胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細(xì)胞凍存。
2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰，蛋，白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。
3、離心1000 rpm,5 min。
4、去除胰，蛋，白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5x10^6/ml~1x10^7/ml。
5、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者。
6、凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)到-25℃以下時(shí)，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
細(xì)胞復(fù)蘇
1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。
2、從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。
3、離心，1000 rpm，5 min。
4、棄去上層清液，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
5、次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活測(cè)試
1、原理：
(1)計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。
(2)血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。
(3)存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之erythrosin bluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100 %。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開始攝取染料;因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。
2、材料：
0.4%w/v trypan blue；erythosin bluish stain；取0.1gram erythrosin bluish、0.05gram preservative methyl paraben溶于100mlca++/mg++freesaline；血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(hemocytometerandcoverslip);計(jì)數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計(jì)數(shù)器(coultercounter,coulterelectronics)。白細(xì)胞稀釋液(4%乙酸溶液)。
3、步驟：
(1)取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue(orerythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
(2)取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-erythrosin bluish)。
(3)計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。
注：
4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×10 4/4=細(xì)胞數(shù)/ml
每一大格的體積
=2.5px×2.5px×0.25px=10-4ml
計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，最，適濃度為5～10×10 5細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。
注意要點(diǎn)
1、冷凍越慢越好，復(fù)蘇越快越好。
2、與液氮接觸的操作，注意戴保護(hù)眼鏡和手套。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，水浴中搖動(dòng)小瓶易爆炸。且dmso為有毒致癌品，接觸時(shí)帶好手套。
3、凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠，一般最，低要達(dá)到5x10^6/ml。濃度視情況而定。
4、做好標(biāo)記：培養(yǎng)瓶上應(yīng)該用馬克筆做好標(biāo)記，寫上細(xì)胞名稱、代數(shù)和凍存時(shí)間。
5、對(duì)剛復(fù)蘇的細(xì)胞動(dòng)作要輕柔，避免細(xì)胞破裂。
6、dmso對(duì)大多數(shù)細(xì)胞不敏感，所以解凍之后不需要除去dmso，解凍后頻繁換液會(huì)慢慢除去dmso。部分對(duì)dmso敏感的細(xì)胞需要除去dmso。
7、解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清，突然換不一樣的培養(yǎng)液和血清會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)不良，甚至死亡。