多路徑體內(nèi)成像對于同時標(biāo)記不同的分子生物標(biāo)志物是非常理想的，能夠跟蹤多個細(xì)胞的遷移和體內(nèi)多種分子的運(yùn)動。通過利用熒光標(biāo)記技術(shù)，活體顯微鏡(ivm)可以在活體動物中同時觀察多種細(xì)胞或分子的活動。然而，即使使用多光子顯微鏡，ivm的組織穿透也高達(dá)400 μ m，難以應(yīng)用到許多臨床前和臨床研究。光學(xué)相干斷層掃描(oct)是一種新興的成像方式，允許組織穿透達(dá)幾毫米，同時在活體中保持高空間分辨率。然而，由于大多數(shù)生物、細(xì)胞和生物分子缺乏固有的oct對比度，傳統(tǒng)的無標(biāo)簽oct僅通過檢測成像組織的背散射光來顯示組織解剖結(jié)構(gòu)。越來越需要開發(fā)合適的oct造影劑，來擴(kuò)大oct在細(xì)胞和分子成像方面的應(yīng)用，特別是通過多重造影劑的方式。到目前為止，已經(jīng)研究了相當(dāng)多的材料作為外源性oct造影劑，包括微球、微泡、磁性納米顆粒和等離子體納米顆粒。已有研究證明在近紅外一區(qū)（nir-i）使用造影劑進(jìn)行多重成像的潛力，但由于nir-i光線穿透率低等。在這項(xiàng)工作中，研究者展示了一類新的oct金納米造影劑(gnbps)，具有更窄的等離子體共振峰和更高的光譜靈敏度。通過合成具有不同寬高比和共振峰的gnbp，可以同一動物體內(nèi)同時顯示多個獨(dú)立淋巴液的流動。在黑色素瘤小鼠中，使用gnbps能夠在體內(nèi)觀測到腫瘤內(nèi)部和腫瘤邊緣的淋巴流動，為研究腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了重要依據(jù)。
gnbp-i和gnbp-ii在體外oct信號對比
使用透射電鏡合成了具有相似的表面形態(tài)但尺寸和縱橫比不同的gnbp-i和gnbp-ii造影劑，nir光譜顯示他們的共振峰分別為1225nm和1415nm。使用將帶寬內(nèi)的oct干涉圖劃分為兩個子帶的雙波段光譜分析來檢測：波段i(1250-1320nm)和波段ii(1321-1400nm)。每個子帶的干涉圖被獨(dú)立重建，在光譜域產(chǎn)生兩幅oct圖像。然后將波段ii oct圖像與波段i oct圖像相減，得到光譜對比信號。為了測量光譜對比信號強(qiáng)度作為每種gnbp濃度的函數(shù)，使用小鼠全血作為參考，在毛細(xì)管中以梯度濃度對gnbp-i和gnbp-ii進(jìn)行成像。在重建的光譜oct b掃描圖像中觀察到水和血液中g(shù)nbp-i和gnbp-ii的兩種不同的光譜對比信號，采用色調(diào)飽和度值(hsv)方案進(jìn)行彩色編碼。gnbp-i表現(xiàn)出正的光譜對比信號，因?yàn)樗鰪?qiáng)了波段i的散射，但降低了波段ii的散射。由于gnbp-ii對兩個子波段的響應(yīng)相反，因此顯示出負(fù)的光譜對比信號，但其在波段ii的散射比波段i更強(qiáng)。采用離散偶極近似方法模擬了兩種gnbp的散射曲線。隨著濃度的增加，兩種gnbp的oct光譜對比信號都更強(qiáng)。分析還表明，gnbp-i的光譜對比信號在5 pm至1 nm范圍內(nèi)隨納米顆粒濃度成比例增加，而gnbp-ii的光譜對比信號在5 ~ 100 pm范圍內(nèi)呈線性增加。當(dāng)納米顆粒濃度超過500 pm時，可以觀察到gnbp-ii的光譜對比信號飽和，計算出gnbp-i和gnbp-ii的檢出限分別為3.6和2.8 pm。
gnbp-i和gnbp-ii和體內(nèi)oct信號隨濃度呈線性相關(guān)
在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，用聚乙二醇(peg, mw 5 kda)對gnbp進(jìn)行偶聯(lián)，以提高其在生物組織中的穩(wěn)定性和生物相容性。為了驗(yàn)證gnbp在體內(nèi)的oct光譜對比信號，使用兩只不同的小鼠耳中皮下注射不同濃度的peg-gnbp-i和peg-gnbp-ii，并在每次給藥后立即在每個注射部位用oct對組織進(jìn)行成像。為了避免不同注射劑之間的影響，每次注射的體積很小(0.1 μ l)。此外，為防止局部注射的gnbp在成像過程中擴(kuò)散到鄰近的注射部位,注射距離至少分開1mm。不注射gnbp的小鼠耳組織作為對照，計算gnbp在組織中流動的光譜對比信號，在hsv方案中結(jié)合oct結(jié)構(gòu)、光譜對比和血流信息創(chuàng)建了橫截面復(fù)合圖像。隨著注射濃度的增加，兩種gnbp在小鼠耳組織中可以觀察到更強(qiáng)的oct光譜對比信號。當(dāng)gnbp-i濃度為5-50 pm，gnbp-ii濃度為5-100 pm時，小鼠耳oct光譜對比信號呈線性增加。
gnbp-i和gnbp-ii能同時顯示體內(nèi)淋巴液的流動
使用peg-gnbp-1和peg-gnbp-ii同時注射到小鼠耳緣皮下不同位置，在每次注射前后對小鼠耳朵進(jìn)行oct掃描并使用雙波段信號處理法生成具有門控的oct圖像，以顯示小鼠體內(nèi)血液和淋巴液的光譜對比。注射造影劑前， oct光譜圖像只顯示血管網(wǎng)絡(luò)，該圖像中的光譜對比度信號接近于零(顏色編碼為青色)由于淋巴液是光學(xué)透明的，因此在流控圖像中沒有信號。在橫截面復(fù)合圖像中，可以看到一條主血管(紅色箭頭表示)和三條淋巴管(黃色箭頭表示)，淋巴管呈現(xiàn)黑色是因?yàn)榱馨鸵寒a(chǎn)生可忽略的光學(xué)反射。在注射gnbp-i后，觀察到除了血流門控oct光譜圖像上的血管外，還有一個廣泛的管狀網(wǎng)絡(luò)，具有高光譜對比度信號。由于他們能夠從間質(zhì)組織中排出造影劑，表明這些管狀網(wǎng)絡(luò)可能是淋巴管。橫斷面復(fù)合圖像顯示，所有三條淋巴管均表現(xiàn)出高光譜對比信號(箭頭)，證實(shí)了注射后流門控oct光譜圖像上出現(xiàn)的光譜陽性網(wǎng)絡(luò)確實(shí)是淋巴管。第一次注射后30分鐘，在耳緣另一個遠(yuǎn)端位置皮下注射第二種造影劑peg-gnbp-ii。第二次注射后，部分淋巴管可見負(fù)的光譜對比信號。在橫截面復(fù)合圖像中，可以在其中一個淋巴管(黃色箭頭)中觀察到負(fù)的光譜對比信號。這些連接可能對應(yīng)于存在于淋巴管室兩端的淋巴閥結(jié)構(gòu)，淋巴管室維持淋巴液的單向流動。
gnbp-i和gnbp-ii能夠在腫瘤內(nèi)部和腫瘤邊緣分別顯示淋巴流動
為了成像腫瘤淋巴引流，先在瘤內(nèi)注射peg-gnbp-i，然后在腫瘤周圍的組織皮下注射peg-gnbp-ii。注射前oct血管造影中可以看到血管生成的腫瘤和瘤周血管。瘤內(nèi)注射后，由于gnbp-i在整個腫瘤內(nèi)擴(kuò)散，整個腫瘤可見陽性的光譜對比信號。從表面流控oct光譜圖像可以很容易地看到瘤內(nèi)注射造影劑的淋巴引流路徑。不僅腫瘤近側(cè)淋巴管可見陽性光譜對比信號，腫瘤遠(yuǎn)側(cè)瘤周淋巴管也可見陽性光譜對比信號。與正常淋巴管相比，瘤周淋巴管的平均血管直徑更大，可能是增生造成的。皮下注射peg-gnbp-ii后，觀察到到不僅在瘤周淋巴管，而且在腫瘤內(nèi)部都可以看到陰性的光譜對比信號，表明gnbp-ii已滲入腫瘤淋巴管。橫斷面復(fù)合圖像顯示，gnbp-ii出現(xiàn)在皮膚表面以下50和160 μ m的淺表和深部腫瘤淋巴管中。淺表淋巴管可能與黑色素瘤周圍真皮組織中的淋巴管相對應(yīng)。然而，位于皮膚表面以下160 μ m的淋巴管對應(yīng)于腫瘤淋巴管。皮下注射gnbp-ii后，腫瘤下游的瘤周淋巴管主要呈現(xiàn)負(fù)的光譜對比信號，可能是由于淋巴管清除導(dǎo)致這些淋巴管中g(shù)nbp-i的濃度降低。
gnbps在黑色素瘤小鼠中追蹤前哨淋巴結(jié)
為了進(jìn)一步研究對比劑注射到兩個不同盆的淋巴引流路徑，在注射前和每次注射后對小鼠耳同側(cè)頸深淋巴結(jié)進(jìn)行了成像。注射前橫斷面復(fù)合圖像上未見淋巴結(jié)淋巴管oct信號。瘤內(nèi)注射30分鐘后，淋巴結(jié)內(nèi)淋巴管可見陽性光譜對比信號。皮下注射30分鐘后，在同一淋巴管中可以觀察到陰性的光譜對比信號。結(jié)果表明，在瘤內(nèi)和皮下注射后，gnbps都被引流到瘤周淋巴管中，然后由頸深淋巴結(jié)收集。在對植入黑色素瘤的小鼠進(jìn)行體內(nèi)成像后，切除了同側(cè)和對側(cè)的頸部深部淋巴結(jié)，并進(jìn)行了體外三維(3d)淋巴管造影。在3-d oct淋巴管光譜圖和橫截面復(fù)合圖像中，同側(cè)頸淋巴結(jié)淋巴管中可見光譜對比信號，但在小鼠對側(cè)淋巴結(jié)中看不到。同側(cè)頸淋巴結(jié)的淋巴管網(wǎng)絡(luò)和淋巴濾泡在三維光譜增強(qiáng)oct淋巴管造影中清晰可見。結(jié)果表明，使用造影劑gnbps追蹤了黑色素瘤中的前哨淋巴結(jié)。
綜上，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了光譜可識別的oct造影劑- gnbp，并證明了peg-gnbp可用于活體動物nir-ii的多重成像。在淋巴研究領(lǐng)域，該技術(shù)可用于異質(zhì)腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成像，也可用于分子成像研究各種淋巴內(nèi)皮細(xì)胞受體在腫瘤血管生成性淋巴管和淋巴結(jié)中的動態(tài)表達(dá)。通過將該技術(shù)應(yīng)用于體內(nèi)腦成像，相信它可以進(jìn)一步揭示在神經(jīng)元炎癥和神經(jīng)退行性疾病中起重要作用的腦淋巴引流通路的奧秘和復(fù)雜性。