摘要:蛋白質(zhì)沉淀技術(shù) (ppt) 是適于 lc/ms/ms 分析的生物體液樣品前處理的常用技術(shù)之一。將蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)用于生物體液樣品，可以從基質(zhì)中有效去除蛋白質(zhì)。本應(yīng)用簡報討論了生物體液樣品 ppt 的重要步驟、考慮因素和注意事項。本文重點介紹使用 captiva emr-lipid 96 孔板的孔內(nèi) ppt，包括合適的沉淀溶劑、比例、添加劑、生物體液基質(zhì)、生物體液樣品等分和沉淀溶劑的板上添加順序、內(nèi)標 (is) 添加，以及板中的樣品混合。后，對使用離心的傳統(tǒng) ppt 和用 captiva emr-lipid 凈化后 ppt 的對比結(jié)果進行了詳細討論，包括時間、方法性能以及對儀器的影響。
前言蛋白質(zhì)沉淀 (ppt) 已廣泛用于 lc/ms/ ms 分析的生物體液樣品前處理1 。將生物體液樣品與 3–5 倍體積可與水混溶的溶劑（如乙腈 (acn)、甲醇 (meoh) 或二者的混合物）混合，來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的有效去除。有機溶劑的添加破壞了蛋白質(zhì)的水化層，降低了蛋白質(zhì)分子間的排斥力，顯著降低了蛋白質(zhì)的溶解度，從而使蛋白質(zhì)沉淀出來。之后，可通過離心或過濾去除沉淀，并將上清液用于分析。即使由于蛋白質(zhì)結(jié)合或受蛋白質(zhì)結(jié)合影響的分析物穩(wěn)定性，導(dǎo)致某些目標分析物可能發(fā)生損失，ppt 方法學(xué)仍然提供了快速、簡單、經(jīng)濟的樣品前處理方法，適用于高通量樣品分析。 captiva emr-lipid 96 孔板可以進行孔內(nèi) ppt，然后進行高效過濾以去除沉淀。此外，emr-lipid 吸附劑可在樣品過濾期間與基質(zhì)中的脂類發(fā)生相互作用，得到更潔凈的洗脫液，同時去除了蛋白質(zhì)和脂類。本應(yīng)用簡報重點討論了使用 captiva emr-lipid 96 孔板的這一重要樣品前處理技術(shù)的關(guān)鍵步驟。
沉淀溶劑與比例可與水混溶的有機溶劑通用于沉淀蛋白質(zhì)，通常是 acn、meoh 或二者的混合物1 。之前的研究中對采用 acn 或 meoh 的 ppt 進行了全面對比2 。使用 acn 進行 ppt 通常會產(chǎn)生大量黃色凝結(jié)沉淀，而 meoh 通常會產(chǎn)生更細的白色凝結(jié)沉淀（圖 1）。上清液的澄清度通常是 ppt 效率的良好指標，渾濁的上清液表明仍然存在未沉淀的蛋白質(zhì)。圖 1a 表明，使用 meoh 和 acn 的小沉淀比分別為 3:1 和 2:1 時，可以獲得澄清的上清液。
圖 1b 表明，樣品在 10 °c 下儲存 24 小時后，以 3:1 的比例使用 acn 可獲得澄清的上清液。結(jié)果清晰表明，acn 可比 meoh 實現(xiàn)更有效的蛋白質(zhì)沉淀，如需實現(xiàn)有效的蛋白質(zhì)去除，有必要將小沉淀比設(shè)為 3:1。然而，更大的沉淀比也會導(dǎo)致樣品更多的稀釋。因此，通常*采用 3:1–5:1 的沉淀比，在實現(xiàn)有效蛋白質(zhì)去除的同時仍保持樣品的適當稀釋
沉淀溶劑的另一個考慮因素是目標分析物的溶劑萃取。acn 和 meoh 可對不同化合物表現(xiàn)出不同的萃取能力。在需要調(diào)節(jié)目標分析物的溶劑可萃取性時，可以添加少部分的 meoh（通常為 5%–15%）。而需要了解的是，即使沉淀溶劑中如此少量的 meoh，也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀呈現(xiàn)出不同的視覺效果（圖 2a 和圖 2b）。與沉淀溶劑混合的 meoh 越多，沉淀就越細，過濾去除沉淀時所需的壓力也就越大。鑒于 meoh 的蛋白質(zhì)沉淀效率低于 acn，過量 meoh 會對 ppt 效率產(chǎn)生不利影響。因此，建議沉淀溶劑中的 meoh 含量不超過 15%。使用 acn（或主要是 acn）作為沉淀溶劑的第三點考慮因素應(yīng)是易于通過過濾去除蛋白質(zhì)沉淀。采用 acn 的 ppt 可產(chǎn)生較大顆粒的蛋白質(zhì)沉淀，這種沉淀不易堵塞濾芯/濾膜，可更輕松地過濾沉淀。采用 meoh 的 ppt 可產(chǎn)生更多更細的沉淀，這種沉淀易于堵塞濾芯/濾膜，因此過濾時需要明顯更大的壓力。
為減少蛋白質(zhì)結(jié)合，通常將甲酸 (fa) 或氫氧化銨 (nh4oh) 等添加劑加入沉淀溶劑中，其中 1% fa 是常用的添加劑。而在全血 ppt 中，應(yīng)謹慎添加酸，因為酸可以提取出更多的血紅蛋白顏色，ppt 后會得到棕色/紅色上清液。圖 2c 和圖 2d 顯示采用中性沉淀溶劑、酸化溶劑（含 1% fa）和堿性溶劑（含 1% nh4oh) 進行 ppt 后的上清液外觀。酸化 ppt 的上清液呈深棕色/紅色。因此，請仔細考慮或避免使用酸化沉淀溶劑來進行全血 ppt。
生物體液生物體液包括全血、血漿、血清、尿液和其他體液。全血、血漿和血清是富含蛋白質(zhì)的主要血液基質(zhì)。因此，在 lc/ms/ms 分析之前有效去除這些蛋白質(zhì)至關(guān)重要。 • 全血是含有抗凝血劑的血液，不會分離為液體部分和血細胞 • 血清是無抗凝劑時與血細胞分離的頂層澄清液體部分，因此血清中不含纖維蛋白原 • 血漿是與血細胞分離的液體部分，含有纖維蛋白原在相同體積下，基質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量遵循全血 > 血漿 > 血清，如 ppt 生成的蛋白質(zhì)沉淀所示（圖 3）。通常認為尿液和其他體液是低蛋白質(zhì)含量基質(zhì)，ppt 仍可廣泛用于這類基質(zhì)，但與血液基質(zhì)相比，這類基質(zhì)實現(xiàn)有效蛋白質(zhì)去除的難度不大。因此，這類生物體液基質(zhì)中采用的沉淀溶劑與沉淀比有更大的靈活性。通常，用于制備這類樣品基質(zhì)的 ppt 被稱為稀釋和上樣。
captiva emr-lipid 板上的孔內(nèi) ppt 高通量批處理中可自動進行 ppt；因此，96 孔板形式得到廣泛采用。在過濾型沉淀去除中，孔內(nèi) ppt 有利于簡化工作流程。而避免由沉淀造成的堵塞對過濾非常重要。agilent captiva 增強型脂質(zhì)去除 emr-lipid (emr-lipid) 吸附劑可在蛋白質(zhì)沉淀后，高選擇性而有效地去除生物體液中的磷脂和其他脂類。這款產(chǎn)品同時采用了深度過濾機制的設(shè)計，可實現(xiàn)無堵塞的高效蛋白質(zhì)沉淀過濾，從而可以使用孔內(nèi) ppt 并簡化工作流程。
血液基質(zhì)（特別是全血）是高粘度液體。之前建議將血清或血漿樣品加入 emrlipid 板的沉淀溶劑中3,4。而將這一方法應(yīng)用于全血樣品，就會出現(xiàn)問題。全血的高粘度使其容易立即沉降在底部，導(dǎo)致樣品混合均勻性過低。一小部分未沉淀的全血可能會流經(jīng) emr-lipid 過濾柱，造成樣品間的顯著差異。有效混合有助于實現(xiàn)*的蛋白質(zhì)沉淀5 。而對于 96 孔板中的全血樣品，由于產(chǎn)生大量沉淀、沉淀堵塞槍頭的高風(fēng)險以及孔間交叉污染，使樣品抽吸混合較為困難。
結(jié)論 ppt 因其簡便性和適用性，廣泛用于制備 lc/ms/ms 分析的生物體液樣品。使用 96 孔板形式的批處理提高了樣品前處理效率，而得到廣泛使用?？變?nèi) ppt + captiva emr-lipid 凈化技術(shù)與傳統(tǒng) ppt 相比具有許多優(yōu)勢，包括簡化的工作流程、蛋白質(zhì)和脂類的同時去除，更高的方法可靠性、高質(zhì)量數(shù)據(jù)以及對檢測儀器更少的影響。根據(jù)分析要求，使用合適的沉淀溶劑類型、比例和添加劑至關(guān)重要。合適的溶劑和樣品添加順序（樣品、is 和沉淀溶劑）是達到有效均勻混合并防止繞過樣品的重要因素。與傳統(tǒng)的單個樣品處理相比，96 孔板上的批處理通常具有更高的交叉污染風(fēng)險；因此，適當?shù)囊埔汉突旌鲜株P(guān)鍵。