原代細(xì)胞分離的基本方法有哪些?

發(fā)布時(shí)間:2024-04-21
人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎)的組織,將其剪碎至1mm3的組織塊,再采用如下方法進(jìn)行原代細(xì)胞
分離培養(yǎng):
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉(zhuǎn)至離心管中,1000rpm/分鐘離心5分鐘。
2、去掉上清,離心沉淀用無(wú)鈣、鎂的pbs清洗后1000rpm/分鐘離心5分鐘。此步重復(fù)兩次。
3、用培養(yǎng)基重懸,調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后分瓶培養(yǎng)。
4、如選用懸液中某種細(xì)胞,可采用離心后的細(xì)胞分層液收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
(一)機(jī)械分散法
1、纖維成分很少的腦組織,部分胚胎組織,用剪刀剪碎至1mm3的組織塊。
2、用pbs清洗兩次后
①用吸管吹打,分散組織細(xì)胞。
②或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號(hào)針),使細(xì)胞通過(guò)針頭壓出。
③或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物(注射器鈍端)壓擠使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。
3、收集細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中,1000rpm/分鐘離心5分鐘。
4、去上清,加入含血清的培養(yǎng)基,重懸后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
(二)消化分離法
1、酶消化分離法(過(guò)夜冷消化法)
①細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等,用hanks液清洗組織三次,剪成碎塊大小為4毫米左右。
②再用hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織。
③加入0.25%的*,搖勻后放4℃過(guò)夜。
④次日再用hanks液洗滌,棄去上清,共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培養(yǎng)基吹打分散,細(xì)胞計(jì)數(shù),按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。
2、非酶消化法(edta消化法)
①把組織塊剪碎,呈1mm3大小的組織塊。
②將碎組織塊在平皿中用無(wú)鈣鎂pbs洗2-3次。
③加入消化液(*或膠原酶或edta)于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間(中間可輕搖1~2次),若組織塊膨松呈絮狀可終止,若變化不大可更換一次消化液,繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。
④棄去上清,加入含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基中止消化反應(yīng),并洗滌2-3次后,加入*培養(yǎng)基。
⑤用吸管吹打,使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)過(guò)濾后分瓶培養(yǎng)。
(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)
原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來(lái),故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段,同時(shí)也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實(shí)踐。例如,用從手術(shù)中切除的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的篩選,根據(jù)腫瘤細(xì)胞對(duì)加入的*藥物的敏感性來(lái)幫助選擇有效的*方案,有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用。
(四)原代細(xì)胞的傳代、保存
(1)傳代:依椐細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),生長(zhǎng)的細(xì)胞1:2或1:3進(jìn)行傳代。
(2)保存:dmso+培養(yǎng)液+血清
按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→超低溫冰箱(-80℃ 過(guò)夜)→液氮。
(五)原代細(xì)胞的復(fù)蘇
(1)取出細(xì)胞,迅速放入37℃溫水中快速解凍。
(2)吸出細(xì)胞懸液,并加10倍以上培養(yǎng)液。
(3)用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶,放入37℃ co2 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
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