發(fā)酵工業(yè)中微生物菌種的退化原因與復壯方法
菌種的退化與復壯
1.菌種的退化現(xiàn)象
隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉接傳代，菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續(xù)，也可能發(fā)生變異。變異有正變異（自發(fā)突變）和負變異兩種，其中負變異即菌株生產性能的劣化或有些遺傳標記的丟失，又稱為菌種的退化。但是在生產實踐中，必須將由于培養(yǎng)條件的導致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開來。因為優(yōu)良菌株的生產性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關的，若培養(yǎng)條件發(fā)生變化，如培養(yǎng)基中缺乏某些元素，會導致產孢子數(shù)量減少，也會引起孢子顏色的改變。溫度、ph的變化也會使發(fā)酵產量發(fā)生波動等，但只要條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。
常見的菌種退化現(xiàn)象中，易覺察到的是菌落形態(tài)、細胞形態(tài)和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變、畸形細胞的出現(xiàn)等；菌株生長變得緩慢，產孢子越來越少直至產孢子能力喪失，例如放線菌、莓菌在斜面上多次傳代后產生“光禿”現(xiàn)象等，從而造成生產上用孢子接種的困難；菌種代謝產物的生產能力或其對宿主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗生素發(fā)酵單位的減少，枯草芽孢桿菌產能力的衰退等。所有這些都對發(fā)酵生產不利。因此，為了使菌種的優(yōu)良性狀延續(xù)下去，必須做好菌種的復壯工作，即在各菌種的優(yōu)良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。
2.菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是相關基因發(fā)生了負突變。當控制產量的基因發(fā)生負突變，就會引起產量下降；當控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則使菌種產孢子性能下降。般而言，菌種的退化是個從量變到質變的逐步演變過程：開始時，在群體中只有個別細胞發(fā)生負突變，這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而是味移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，后占優(yōu)勢，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴重的退化現(xiàn)象，因此，突變在數(shù)上的表現(xiàn)依賴于傳代，即菌株處于定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯，逐漸成為株退化了的菌體。同時，對某菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發(fā)生生產性能的突變不是很容易的，但就個經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細胞而言，發(fā)生突變的概率比處于休眠狀態(tài)的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關系密切，應設法控制細胞保藏的環(huán)境，使細胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化，
3.防止退化的措施
（1）合理的育種
選育菌種時所處理的細胞應使用單核的，避免使用多核細胞；合理選釋誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少回復突變；在誘變處理后進行充分的后培養(yǎng)及純化突變，以保證保藏藍種純粹。這些都可有效地防止菌種的退化。
（2）選用合適的培養(yǎng)基
有人發(fā)現(xiàn)用老苜著根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生藍——細黃鏈霉菌可以防止它的退化，在赤霉菌產生菌藤倉赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天門冬素、、5-核苷酸或等物質時，也有防止菌種退化的效果，也可選取營養(yǎng)相對貧乏的培養(yǎng)基作為菌種保藏培養(yǎng)基，如培養(yǎng)基中適當限制容易利用的葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過藍株的生長繁殖而產生的，當培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態(tài)，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化概率。
（3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件
在生產實踐中，創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)個適合原種生長的條件可以防止菌種遲化，如低溫、于燥、缺氧等。在棲土曲霉3.942的培養(yǎng)中，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施（從20~30℃提高到33~34℃）來防止其產孢子能力的退化。
（4）控制傳代次數(shù)
由于微生物存在著自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過程中發(fā)生的，所以應盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的概率，菌種傳代次數(shù)越多，產生突變的凝率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產實踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數(shù)，并根據(jù)菌種保藏方法的不同，確立恰當?shù)囊品N傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其他的保藏方式（真空冷凍于燥保藏、沙土管保藏、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
（5）利用不同類型的細胞進行移種傳代
在有些薇生物中，如放線菌和霉菌，由于其細胞中常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)不純和衰退的現(xiàn)象，而孢子般是單核的，用它接種時就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生，有人在實踐中發(fā)現(xiàn)構巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地蘸取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。
4.退化菌種的復壯
退化菌種的復壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現(xiàn)，其中種是從退化菌種的群體中找出少數(shù)尚未退化的個體，以恢復菌種原有的典型性狀。另種是在菌種的生產性能尚未退化前就經(jīng)常有意識地進行純種分離和生產性能的測定工作，以使菌種的生產性能逐步提高。所以這實際上是種利用自發(fā)突變不斷從生產中進行選種的工作。
其體的菌種的復壯措施如下。
（1）純種分離
采用平板劃線分離法、平板稀釋法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細胞分離出來，經(jīng)擴大培養(yǎng)恢復原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經(jīng)培養(yǎng)恢復原菌株性狀。
（2）通過宿主進行復壯
寄生型數(shù)生物的退化菌株可接種到相應宿主體內以提高菌株的活力，
（3）聯(lián)合復壯
對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的dtg聯(lián)合處理進行復壯。