自從篇介紹原位雜交作為檢測(cè)和研究染色體和細(xì)胞中dna序列的方法的研究論文發(fā)表以來,已經(jīng)過去了近25年。然而,在過去的15年中,通過發(fā)展熒光技術(shù)使光學(xué)顯微鏡發(fā)生了突破,該技術(shù)允許以的簡(jiǎn)便性,精確度和準(zhǔn)確性來定位,識(shí)別和記錄生物醫(yī)學(xué)樣品的基因組成數(shù)據(jù)。
圖1-多色fish實(shí)驗(yàn)
同時(shí)使用多種熒光色可以大大擴(kuò)展原位雜交的能力。的多色熒光原位雜交(fish)可用于識(shí)別與雜交中使用的不同熒光團(tuán)一樣多的標(biāo)記特征。通過不僅使用單色,而且使用顏色的組合,可以使用數(shù)字成像顯微鏡在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)更多標(biāo)記的特征。
在呈現(xiàn)圖1是一個(gè)典型的多色fish標(biāo)本。正常雄性淋巴細(xì)胞與fitc*標(biāo)記的chr21和chry探針以及cy3洋地黃毒苷標(biāo)記的chrl3和chry探針雜交。左上方是使用dapi濾鏡組拍攝的dapi染色的dna核圖像。右上方是使用fitc濾鏡組拍攝的用fitc染色的chr21和chry圖像。左下方是使用cy3濾鏡組拍攝的chrl3和chry染色的cy3圖像。右下方的圖像是合并的彩色合成圖像,顯示了所有目標(biāo)染色體的顏色。標(biāo)本由馬薩諸塞州弗雷明漢的整合遺傳學(xué)的蒂姆·豪斯?fàn)柌┦刻峁?br>如今,多色fish技術(shù)與數(shù)字成像技術(shù)相結(jié)合,為多種同位素序列的非同位素檢測(cè)提供了*的功能,可用于分析細(xì)胞成分,染色體和基因。
在整個(gè)生命科學(xué)中,熒光是一種在一種光波長(zhǎng)下激發(fā)化學(xué)物質(zhì)發(fā)出不同波長(zhǎng)(通常更長(zhǎng))的光的現(xiàn)象,用于研究各種各樣的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)活性。在過去的十年中,探針和顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致熒光技術(shù)的飛速發(fā)展。
這篇評(píng)論文章將介紹fish技術(shù)的基礎(chǔ)知識(shí)。研究人員多年來在使用fish方面面臨的局限性;影響該技術(shù)發(fā)展的硬件,軟件,探針和試劑的發(fā)展;和該領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)。隨著該技術(shù)開始從單純的研究擴(kuò)展到臨床診斷環(huán)境,fish的新發(fā)展也將得到審查。
fish技術(shù)概述fish在基因組學(xué),細(xì)胞遺傳學(xué),產(chǎn)前研究,腫瘤生物學(xué),放射標(biāo)記,基因作圖,基因擴(kuò)增和基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究中正在迅速增長(zhǎng)。原則上,該技術(shù)非常簡(jiǎn)單。
雜交反應(yīng)識(shí)別或標(biāo)記了靶基因組序列,因此可以研究其位置和大小。首先用報(bào)告分子標(biāo)記來自適當(dāng)?shù)娜旧w特異性探針的dna或rna序列,然后通過熒光顯微鏡鑒定。然后將標(biāo)記的dna或rna探針與載玻片上的中期染色體或相間核雜交。洗滌和信號(hào)放大后,通過熒光顯微鏡檢查樣本中的報(bào)告分子。
fish可以對(duì)形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行非常精確的空間解析。該技術(shù)快速,易于實(shí)施,并提供出色的探針穩(wěn)定性。取決于所使用的探針,可以鑒定出特定物種的基因組,整個(gè)染色體,染色體特異性區(qū)域或單拷貝*序列。
以前的局限性直到近,fish仍受硬件,軟件,試劑,探針技術(shù)以及實(shí)施該技術(shù)涉及的成本的限制。
針對(duì)多色fish優(yōu)化的市售顯微鏡硬件直到1990年代中期才面市。在此之前,必須為fish應(yīng)用定制顯微鏡。大多數(shù)顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)并非旨在檢測(cè)fish信號(hào)固有的弱光水平。隨著該技術(shù)的基因組分辨率的顯著提高,對(duì)顯微鏡光學(xué)器件的要求也進(jìn)一步提高。多個(gè)波長(zhǎng)之間的色差是個(gè)問題。特別是對(duì)于多色分析,所有透鏡(包括集光透鏡)都必須進(jìn)行色校正。另外,落射熒光光源難以對(duì)準(zhǔn)以均勻照明。
要分析多色fish圖像,需要使用(a)各個(gè)激發(fā)塊隔離各種信號(hào)?;颍╞)使用帶有多通二向色和勢(shì)壘濾波器的激勵(lì)濾光輪。濾光器技術(shù)的發(fā)展糾正了由單個(gè)濾光器立方體的機(jī)械切換引起的光學(xué)失準(zhǔn)所遇到的一些先前的問題。與多通二向色濾光片和勢(shì)壘濾光片一起使用的勵(lì)磁濾光輪可以通過對(duì)每種顏色采用單獨(dú)的勵(lì)磁濾光片而沒有套準(zhǔn)偏移的方式有效地用于多達(dá)三種顏色。但是,對(duì)于三種以上的顏色,仍然必須使用單通濾鏡。
高速彩色膠片或ccd(電荷耦合器件)相機(jī)被用來收集數(shù)據(jù),并且色彩保真度存在問題。此外,在單個(gè)樣本中疊加使用不同探針獲取的不同顏色圖像的過程也存在限制。
可以定量分析使用熒光試劑制備的樣品的成像軟件也受到限制,因?yàn)楝F(xiàn)有的圖像分析系統(tǒng)并未針對(duì)熒光樣品進(jìn)行優(yōu)化。視覺分析是一項(xiàng)勞動(dòng)密集型工作,通常是主觀的過程,在某些情況下,如果不使用高級(jí)熒光成像功能,則對(duì)熒光樣品的分析將非常困難且模棱兩可。研究人員通常必須由軟件開發(fā)人員來創(chuàng)建自己的內(nèi)部圖像分析軟件。幸運(yùn)的是,今天制造商提供了許多軟件選項(xiàng),包括尼康的nis-elements顯微鏡軟件。
試劑和探針本身不足以用于所有應(yīng)用。例如,雜交位點(diǎn)檢測(cè)的效率隨探針尺寸的減小而降低,從而大大限制了通過熒光顯微鏡觀察到的結(jié)果。不同顏色的熒光染料的數(shù)量是有限的,并且染料的光穩(wěn)定性差。但是聯(lián)邦政府資助的人類基因組計(jì)劃的熒光染料技術(shù)和衍生技術(shù)的新發(fā)展現(xiàn)在正在產(chǎn)生影響。有所有人類染色體的探針,并且越來越多的新基因特異性探針可供使用。原位雜交試劑盒和熒光標(biāo)記探針可從幾家公司購(gòu)得。
成本是另一個(gè)主要障礙。由于市場(chǎng)上沒有市售的fish系統(tǒng),因此研究人員必須組裝定制系統(tǒng),包括試劑,探針,顯微鏡,成像硬件,軟件以及數(shù)據(jù)分析和報(bào)告功能。要同時(shí)執(zhí)行多色fish和復(fù)雜的圖像分析,研究人員可能要花費(fèi)20萬美元以上,對(duì)于大多數(shù)臨床研究人員而言,這筆錢不容易獲得。結(jié)果,許多希望在實(shí)驗(yàn)室中使用fish的研究科學(xué)家被禁止這樣做。
fish已廣泛可用許多硬件和軟件制造商已經(jīng)開發(fā)出了一些方法來創(chuàng)建自定義系統(tǒng)的可負(fù)擔(dān)的商業(yè)替代方案。參與fish的許多公司和實(shí)驗(yàn)室之間已經(jīng)形成了合作精神,從而可以取得新的突破。作者將根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)將這些發(fā)展作為此類系統(tǒng)的示例。
在美國(guó)使用的系統(tǒng)提供了一種中等價(jià)位的商業(yè)化fish研究系統(tǒng),該系統(tǒng)包括許多制造商的組件,并依賴于圖像分析軟件,顯微鏡硬件和配件的發(fā)展。臨床研究實(shí)驗(yàn)室將發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)可用于多種應(yīng)用。該系統(tǒng)提供了集成和自動(dòng)化功能,以終處理臨床測(cè)試量。
圖2 -multifluor軟件數(shù)據(jù)屏幕
此處說明的軟件系統(tǒng)是multifluor(tm)多參數(shù)成像軟件(biological detection systems),它是一種基于microsoft® windows(microsoft corp., bellevue, wa)的系統(tǒng),可以檢測(cè),分析和顯示多色的結(jié)構(gòu)和分子特征。fish樣品。通過關(guān)聯(lián)在每個(gè)樣品中在各種波長(zhǎng)下測(cè)量的多個(gè)特征,可以提高分析時(shí)間和準(zhǔn)確性。該系統(tǒng)有助于圖像采集,圖像存儲(chǔ),數(shù)據(jù)庫(kù)管理,顯微鏡自動(dòng)化控制和全功能圖形數(shù)據(jù)分析。
所示圖2是multifluor軟件數(shù)據(jù)查看屏幕。用戶可以一起查看圖像和相應(yīng)的數(shù)據(jù),并使用各種交互式圖形繪圖工具(包括直方圖,散點(diǎn)圖等)將來自多種顏色(波長(zhǎng))的多參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。此處,顯示了多個(gè)數(shù)據(jù)圖以及所選的多色圖像集細(xì)胞(顯示dapi核,fitc-chrx,cy3-chry和cy5-chr21)以及表中顯示的原始數(shù)據(jù)測(cè)量值。
fish研究人員可以自動(dòng)捕獲多個(gè)波長(zhǎng)和多個(gè)焦平面上的圖像,可視化多色fish探針,注釋和打印出圖像,以及存儲(chǔ)和檢索大量的多色圖像數(shù)據(jù)集??梢苑治龆嗌玣ish中期染色體,包括基因作圖,cgh(比較基因組雜交)比率和核型生成。用戶選擇的樣品區(qū)域可以被掃描和分析。該軟件可自動(dòng)聚焦,獲取多種波長(zhǎng)的圖像,記錄細(xì)胞的玻片位置并測(cè)量多種功能,包括探針計(jì)數(shù),熒光強(qiáng)度和細(xì)胞形態(tài)??梢躁P(guān)聯(lián)來自各種波長(zhǎng)的多個(gè)特征。
該系統(tǒng)的另一個(gè)功能是可以與聯(lián)網(wǎng)的個(gè)人計(jì)算機(jī)(pc)一起使用。在典型設(shè)置中,一臺(tái)pc是連接到相機(jī)和顯微鏡硬件的在線分析站。該pc可處理圖像采集和即時(shí)分析。其他pc充當(dāng)輔助檢查站,以分析臺(tái)pc產(chǎn)生的結(jié)果,或離線執(zhí)行專門的分析。
該軟件允許所有圖像成分以生動(dòng)的偽彩色顯示,以實(shí)現(xiàn)多色同時(shí)成像。例如,使用dapi(藍(lán)色),fitc(綠色),cy3(紅色)和fitc-cy3(黃色)的組合同時(shí)進(jìn)行四色實(shí)驗(yàn)的圖像都可以單獨(dú)顯示,也可以組合以形成彩色合成圖像圖像(如圖1所示)??梢越换ピ鰪?qiáng)每個(gè)圖像以顯示感興趣的特征。此外,可以通過該軟件輕松創(chuàng)建直方圖,散點(diǎn)圖,電子表格,折線圖以及其他形式的數(shù)據(jù)列表和查看(圖2)。后,數(shù)據(jù)以易于訪問的流行數(shù)據(jù)庫(kù)格式維護(hù),并且可以存儲(chǔ)為tiff,jpeg,gif或其他文件。
落射照明自動(dòng)化顯微鏡硬件也是系統(tǒng)的一部分。optiphot后來模型顯微鏡系統(tǒng)(尼康儀器公司,梅爾維爾,紐約)有一個(gè)自動(dòng)化的,計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的xyz載物臺(tái)和聚焦系統(tǒng),設(shè)計(jì)成存儲(chǔ)每個(gè)對(duì)象的坐標(biāo)。因此,只需在重新定位的細(xì)胞按鈕上單擊鼠標(biāo),即可立即在顯微鏡載玻片上重新調(diào)用重要的細(xì)胞和染色體位點(diǎn),從而可以進(jìn)行更廣泛的顯微鏡視覺檢查或檢查。
顯微鏡系統(tǒng)重要的優(yōu)點(diǎn)之一是為fish應(yīng)用設(shè)計(jì)了照明器。quadfluor(tm)和以后的模型落射熒光照明器(nikon instruments inc.)多可容納四個(gè)熒光濾光片立方體,并顯著提高亮度和對(duì)比度,這對(duì)于使用多種熒光染料的研究人員來說是重要的好處。
使用照明器,執(zhí)行fish和其他高級(jí)熒光技術(shù)的研究人員可以自由地使用四個(gè)或更多不同的探頭,而不必停下來更換激發(fā)塊。通過用于在四個(gè)濾鏡之間切換的非常精確的線性滑塊的平滑運(yùn)動(dòng),可以確保出色的圖像配準(zhǔn)。
濾光片立方體通過使用激勵(lì)器,二向色性和擋板濾光器技術(shù)提供更高的亮度和很高的對(duì)比度;內(nèi)部擋光板 擋板過濾器的高精度傾斜安裝角度;和專有的抗反射涂層。此外,落射熒光照明器一次多可容納四個(gè)立方體,以分離不同的熒光信號(hào),或者可與多波段濾光片立方體一起使用,以同時(shí)對(duì)幾種熒光染料進(jìn)行成像。
高透射物鏡對(duì)于成像染色體上的微小目標(biāo)區(qū)域也至關(guān)重要。所述cfi60計(jì)劃氟目標(biāo)(尼康儀器公司)設(shè)有光學(xué)水泥和高透射的涂層,以允許更廣泛的波長(zhǎng)范圍和明亮的圖像。物鏡沒有顏色和球差,并且提供*的對(duì)比度和極低的背景自發(fā)熒光。
一些制造商目前正在開發(fā)其他計(jì)算機(jī)控制的顯微鏡附件,以創(chuàng)建*的電動(dòng)系統(tǒng),這些系統(tǒng)將是模塊化的,并且對(duì)于研究和臨床應(yīng)用而言價(jià)格甚至更低。相機(jī)是系統(tǒng)的另一個(gè)重要考慮因素。可以使用數(shù)字ccd或增強(qiáng)型攝像機(jī)獲取圖像。系統(tǒng)中的關(guān)鍵因素是它們?cè)诓粻奚U娑鹊那闆r下執(zhí)行弱光成像的能力。使用適當(dāng)?shù)能浖?,可以通過全自動(dòng)顯微鏡自動(dòng)設(shè)置相機(jī)設(shè)置,以確保準(zhǔn)確性和易用性。
癌癥,產(chǎn)前和生物學(xué)研究與舊的定制系統(tǒng)相比,此處描述的fish系統(tǒng)旨在讓更多的研究人員可以使用,并且正在廣泛用于癌癥研究,病理學(xué),細(xì)胞遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)中。它們的應(yīng)用包括分析相間細(xì)胞的多色探針斑點(diǎn)計(jì)數(shù),免疫表型,細(xì)胞形態(tài)和dna含量。
該系統(tǒng)正在測(cè)試染色體拷貝數(shù)的畸變,該畸變與總dna含量相關(guān),并與膀胱腫瘤有關(guān)。在產(chǎn)前研究中,該系統(tǒng)可用于測(cè)試與產(chǎn)前缺陷(包括唐氏綜合癥,特納氏綜合癥,克林費(fèi)爾特氏綜合癥等)相關(guān)的相間核的非整倍性。在細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)研究中,該系統(tǒng)可用于繪制細(xì)胞表面標(biāo)志物(例如受體),細(xì)胞質(zhì)標(biāo)志物(包括細(xì)胞骨架蛋白,信使rna和特定基因)的存在和相對(duì)分布。
診斷潛力在過去的十五年中,研究人員已經(jīng)知道,fish技術(shù)具有巨大的潛力,不僅可以用作純粹的研究工具,而且可以用于產(chǎn)前診斷,細(xì)胞遺傳學(xué)和腫瘤評(píng)估等領(lǐng)域的臨床診斷。缺乏高級(jí)的,價(jià)格適中的系統(tǒng),不僅減慢了大多數(shù)研究人員使用fish的速度,而且還阻止了該技術(shù)在診斷性醫(yī)療保健環(huán)境中不可避免地?cái)U(kuò)展。
該系統(tǒng)重要的影響之一是它可以提供高級(jí)結(jié)果,而以前只有昂貴的定制配置系統(tǒng)才能提供。在不久的將來,將fish不僅應(yīng)用于更廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用中,而且還可以滿足患者的直接需求的夢(mèng)想可能會(huì)成為現(xiàn)實(shí)。