自從篇介紹原位雜交作為檢測(cè)和研究染色體和細(xì)胞中dna序列的方法的研究論文發(fā)表以來，已經(jīng)過去了近25年。然而，在過去的15年中，通過發(fā)展熒光技術(shù)使光學(xué)顯微鏡發(fā)生了突破，該技術(shù)允許以的簡(jiǎn)便性，精確度和準(zhǔn)確性來定位，識(shí)別和記錄生物醫(yī)學(xué)樣品的基因組成數(shù)據(jù)。
圖1-多色fish實(shí)驗(yàn)
同時(shí)使用多種熒光色可以大大擴(kuò)展原位雜交的能力。的多色熒光原位雜交（fish）可用于識(shí)別與雜交中使用的不同熒光團(tuán)一樣多的標(biāo)記特征。通過不僅使用單色，而且使用顏色的組合，可以使用數(shù)字成像顯微鏡在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)更多標(biāo)記的特征。
在呈現(xiàn)圖1是一個(gè)典型的多色fish標(biāo)本。正常雄性淋巴細(xì)胞與fitc*標(biāo)記的chr21和chry探針以及cy3洋地黃毒苷標(biāo)記的chrl3和chry探針雜交。左上方是使用dapi濾鏡組拍攝的dapi染色的dna核圖像。右上方是使用fitc濾鏡組拍攝的用fitc染色的chr21和chry圖像。左下方是使用cy3濾鏡組拍攝的chrl3和chry染色的cy3圖像。右下方的圖像是合并的彩色合成圖像，顯示了所有目標(biāo)染色體的顏色。標(biāo)本由馬薩諸塞州弗雷明漢的整合遺傳學(xué)的蒂姆·豪斯?fàn)柌┦刻峁?br>如今，多色fish技術(shù)與數(shù)字成像技術(shù)相結(jié)合，為多種同位素序列的非同位素檢測(cè)提供了*的功能，可用于分析細(xì)胞成分，染色體和基因。
在整個(gè)生命科學(xué)中，熒光是一種在一種光波長(zhǎng)下激發(fā)化學(xué)物質(zhì)發(fā)出不同波長(zhǎng)（通常更長(zhǎng)）的光的現(xiàn)象，用于研究各種各樣的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)活性。在過去的十年中，探針和顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致熒光技術(shù)的飛速發(fā)展。
這篇評(píng)論文章將介紹fish技術(shù)的基礎(chǔ)知識(shí)。研究人員多年來在使用fish方面面臨的局限性；影響該技術(shù)發(fā)展的硬件，軟件，探針和試劑的發(fā)展；和該領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)。隨著該技術(shù)開始從單純的研究擴(kuò)展到臨床診斷環(huán)境，fish的新發(fā)展也將得到審查。
fish技術(shù)概述fish在基因組學(xué)，細(xì)胞遺傳學(xué)，產(chǎn)前研究，腫瘤生物學(xué)，放射標(biāo)記，基因作圖，基因擴(kuò)增和基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究中正在迅速增長(zhǎng)。原則上，該技術(shù)非常簡(jiǎn)單。
雜交反應(yīng)識(shí)別或標(biāo)記了靶基因組序列，因此可以研究其位置和大小。首先用報(bào)告分子標(biāo)記來自適當(dāng)?shù)娜旧w特異性探針的dna或rna序列，然后通過熒光顯微鏡鑒定。然后將標(biāo)記的dna或rna探針與載玻片上的中期染色體或相間核雜交。洗滌和信號(hào)放大后，通過熒光顯微鏡檢查樣本中的報(bào)告分子。
fish可以對(duì)形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行非常精確的空間解析。該技術(shù)快速，易于實(shí)施，并提供出色的探針穩(wěn)定性。取決于所使用的探針，可以鑒定出特定物種的基因組，整個(gè)染色體，染色體特異性區(qū)域或單拷貝*序列。
以前的局限性直到近，fish仍受硬件，軟件，試劑，探針技術(shù)以及實(shí)施該技術(shù)涉及的成本的限制。
針對(duì)多色fish優(yōu)化的市售顯微鏡硬件直到1990年代中期才面市。在此之前，必須為fish應(yīng)用定制顯微鏡。大多數(shù)顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)并非旨在檢測(cè)fish信號(hào)固有的弱光水平。隨著該技術(shù)的基因組分辨率的顯著提高，對(duì)顯微鏡光學(xué)器件的要求也進(jìn)一步提高。多個(gè)波長(zhǎng)之間的色差是個(gè)問題。特別是對(duì)于多色分析，所有透鏡（包括集光透鏡）都必須進(jìn)行色校正。另外，落射熒光光源難以對(duì)準(zhǔn)以均勻照明。
要分析多色fish圖像，需要使用（a）各個(gè)激發(fā)塊隔離各種信號(hào)?；颍╞）使用帶有多通二向色和勢(shì)壘濾波器的激勵(lì)濾光輪。濾光器技術(shù)的發(fā)展糾正了由單個(gè)濾光器立方體的機(jī)械切換引起的光學(xué)失準(zhǔn)所遇到的一些先前的問題。與多通二向色濾光片和勢(shì)壘濾光片一起使用的勵(lì)磁濾光輪可以通過對(duì)每種顏色采用單獨(dú)的勵(lì)磁濾光片而沒有套準(zhǔn)偏移的方式有效地用于多達(dá)三種顏色。但是，對(duì)于三種以上的顏色，仍然必須使用單通濾鏡。
高速彩色膠片或ccd（電荷耦合器件）相機(jī)被用來收集數(shù)據(jù)，并且色彩保真度存在問題。此外，在單個(gè)樣本中疊加使用不同探針獲取的不同顏色圖像的過程也存在限制。
可以定量分析使用熒光試劑制備的樣品的成像軟件也受到限制，因?yàn)楝F(xiàn)有的圖像分析系統(tǒng)并未針對(duì)熒光樣品進(jìn)行優(yōu)化。視覺分析是一項(xiàng)勞動(dòng)密集型工作，通常是主觀的過程，在某些情況下，如果不使用高級(jí)熒光成像功能，則對(duì)熒光樣品的分析將非常困難且模棱兩可。研究人員通常必須由軟件開發(fā)人員來創(chuàng)建自己的內(nèi)部圖像分析軟件。幸運(yùn)的是，今天制造商提供了許多軟件選項(xiàng)，包括尼康的nis-elements顯微鏡軟件。
試劑和探針本身不足以用于所有應(yīng)用。例如，雜交位點(diǎn)檢測(cè)的效率隨探針尺寸的減小而降低，從而大大限制了通過熒光顯微鏡觀察到的結(jié)果。不同顏色的熒光染料的數(shù)量是有限的，并且染料的光穩(wěn)定性差。但是聯(lián)邦政府資助的人類基因組計(jì)劃的熒光染料技術(shù)和衍生技術(shù)的新發(fā)展現(xiàn)在正在產(chǎn)生影響。有所有人類染色體的探針，并且越來越多的新基因特異性探針可供使用。原位雜交試劑盒和熒光標(biāo)記探針可從幾家公司購(gòu)得。
成本是另一個(gè)主要障礙。由于市場(chǎng)上沒有市售的fish系統(tǒng)，因此研究人員必須組裝定制系統(tǒng)，包括試劑，探針，顯微鏡，成像硬件，軟件以及數(shù)據(jù)分析和報(bào)告功能。要同時(shí)執(zhí)行多色fish和復(fù)雜的圖像分析，研究人員可能要花費(fèi)20萬美元以上，對(duì)于大多數(shù)臨床研究人員而言，這筆錢不容易獲得。結(jié)果，許多希望在實(shí)驗(yàn)室中使用fish的研究科學(xué)家被禁止這樣做。
fish已廣泛可用許多硬件和軟件制造商已經(jīng)開發(fā)出了一些方法來創(chuàng)建自定義系統(tǒng)的可負(fù)擔(dān)的商業(yè)替代方案。參與fish的許多公司和實(shí)驗(yàn)室之間已經(jīng)形成了合作精神，從而可以取得新的突破。作者將根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)將這些發(fā)展作為此類系統(tǒng)的示例。
在美國(guó)使用的系統(tǒng)提供了一種中等價(jià)位的商業(yè)化fish研究系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括許多制造商的組件，并依賴于圖像分析軟件，顯微鏡硬件和配件的發(fā)展。臨床研究實(shí)驗(yàn)室將發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)可用于多種應(yīng)用。該系統(tǒng)提供了集成和自動(dòng)化功能，以終處理臨床測(cè)試量。
圖2 -multifluor軟件數(shù)據(jù)屏幕
此處說明的軟件系統(tǒng)是multifluor（tm）多參數(shù)成像軟件（biological detection systems），它是一種基于microsoft® windows（microsoft corp., bellevue, wa）的系統(tǒng)，可以檢測(cè)，分析和顯示多色的結(jié)構(gòu)和分子特征。fish樣品。通過關(guān)聯(lián)在每個(gè)樣品中在各種波長(zhǎng)下測(cè)量的多個(gè)特征，可以提高分析時(shí)間和準(zhǔn)確性。該系統(tǒng)有助于圖像采集，圖像存儲(chǔ)，數(shù)據(jù)庫(kù)管理，顯微鏡自動(dòng)化控制和全功能圖形數(shù)據(jù)分析。
所示圖2是multifluor軟件數(shù)據(jù)查看屏幕。用戶可以一起查看圖像和相應(yīng)的數(shù)據(jù)，并使用各種交互式圖形繪圖工具（包括直方圖，散點(diǎn)圖等）將來自多種顏色（波長(zhǎng)）的多參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。此處，顯示了多個(gè)數(shù)據(jù)圖以及所選的多色圖像集細(xì)胞（顯示dapi核，fitc-chrx，cy3-chry和cy5-chr21）以及表中顯示的原始數(shù)據(jù)測(cè)量值。
fish研究人員可以自動(dòng)捕獲多個(gè)波長(zhǎng)和多個(gè)焦平面上的圖像，可視化多色fish探針，注釋和打印出圖像，以及存儲(chǔ)和檢索大量的多色圖像數(shù)據(jù)集?？梢苑治龆嗌玣ish中期染色體，包括基因作圖，cgh（比較基因組雜交）比率和核型生成。用戶選擇的樣品區(qū)域可以被掃描和分析。該軟件可自動(dòng)聚焦，獲取多種波長(zhǎng)的圖像，記錄細(xì)胞的玻片位置并測(cè)量多種功能，包括探針計(jì)數(shù)，熒光強(qiáng)度和細(xì)胞形態(tài)?？梢躁P(guān)聯(lián)來自各種波長(zhǎng)的多個(gè)特征。
該系統(tǒng)的另一個(gè)功能是可以與聯(lián)網(wǎng)的個(gè)人計(jì)算機(jī)（pc）一起使用。在典型設(shè)置中，一臺(tái)pc是連接到相機(jī)和顯微鏡硬件的在線分析站。該pc可處理圖像采集和即時(shí)分析。其他pc充當(dāng)輔助檢查站，以分析臺(tái)pc產(chǎn)生的結(jié)果，或離線執(zhí)行專門的分析。
該軟件允許所有圖像成分以生動(dòng)的偽彩色顯示，以實(shí)現(xiàn)多色同時(shí)成像。例如，使用dapi（藍(lán)色），fitc（綠色），cy3（紅色）和fitc-cy3（黃色）的組合同時(shí)進(jìn)行四色實(shí)驗(yàn)的圖像都可以單獨(dú)顯示，也可以組合以形成彩色合成圖像圖像（如圖1所示）?？梢越换ピ鰪?qiáng)每個(gè)圖像以顯示感興趣的特征。此外，可以通過該軟件輕松創(chuàng)建直方圖，散點(diǎn)圖，電子表格，折線圖以及其他形式的數(shù)據(jù)列表和查看（圖2）。后，數(shù)據(jù)以易于訪問的流行數(shù)據(jù)庫(kù)格式維護(hù)，并且可以存儲(chǔ)為tiff，jpeg，gif或其他文件。
落射照明自動(dòng)化顯微鏡硬件也是系統(tǒng)的一部分。optiphot后來模型顯微鏡系統(tǒng)（尼康儀器公司，梅爾維爾，紐約）有一個(gè)自動(dòng)化的，計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的xyz載物臺(tái)和聚焦系統(tǒng)，設(shè)計(jì)成存儲(chǔ)每個(gè)對(duì)象的坐標(biāo)。因此，只需在重新定位的細(xì)胞按鈕上單擊鼠標(biāo)，即可立即在顯微鏡載玻片上重新調(diào)用重要的細(xì)胞和染色體位點(diǎn)，從而可以進(jìn)行更廣泛的顯微鏡視覺檢查或檢查。
顯微鏡系統(tǒng)重要的優(yōu)點(diǎn)之一是為fish應(yīng)用設(shè)計(jì)了照明器。quadfluor（tm）和以后的模型落射熒光照明器（nikon instruments inc.）多可容納四個(gè)熒光濾光片立方體，并顯著提高亮度和對(duì)比度，這對(duì)于使用多種熒光染料的研究人員來說是重要的好處。
使用照明器，執(zhí)行fish和其他高級(jí)熒光技術(shù)的研究人員可以自由地使用四個(gè)或更多不同的探頭，而不必停下來更換激發(fā)塊。通過用于在四個(gè)濾鏡之間切換的非常精確的線性滑塊的平滑運(yùn)動(dòng)，可以確保出色的圖像配準(zhǔn)。
濾光片立方體通過使用激勵(lì)器，二向色性和擋板濾光器技術(shù)提供更高的亮度和很高的對(duì)比度；內(nèi)部擋光板 擋板過濾器的高精度傾斜安裝角度；和專有的抗反射涂層。此外，落射熒光照明器一次多可容納四個(gè)立方體，以分離不同的熒光信號(hào)，或者可與多波段濾光片立方體一起使用，以同時(shí)對(duì)幾種熒光染料進(jìn)行成像。
高透射物鏡對(duì)于成像染色體上的微小目標(biāo)區(qū)域也至關(guān)重要。所述cfi60計(jì)劃氟目標(biāo)（尼康儀器公司）設(shè)有光學(xué)水泥和高透射的涂層，以允許更廣泛的波長(zhǎng)范圍和明亮的圖像。物鏡沒有顏色和球差，并且提供*的對(duì)比度和極低的背景自發(fā)熒光。
一些制造商目前正在開發(fā)其他計(jì)算機(jī)控制的顯微鏡附件，以創(chuàng)建*的電動(dòng)系統(tǒng)，這些系統(tǒng)將是模塊化的，并且對(duì)于研究和臨床應(yīng)用而言價(jià)格甚至更低。相機(jī)是系統(tǒng)的另一個(gè)重要考慮因素。可以使用數(shù)字ccd或增強(qiáng)型攝像機(jī)獲取圖像。系統(tǒng)中的關(guān)鍵因素是它們?cè)诓粻奚Ｕ娑鹊那闆r下執(zhí)行弱光成像的能力。使用適當(dāng)?shù)能浖?，可以通過全自動(dòng)顯微鏡自動(dòng)設(shè)置相機(jī)設(shè)置，以確保準(zhǔn)確性和易用性。
癌癥，產(chǎn)前和生物學(xué)研究與舊的定制系統(tǒng)相比，此處描述的fish系統(tǒng)旨在讓更多的研究人員可以使用，并且正在廣泛用于癌癥研究，病理學(xué)，細(xì)胞遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)中。它們的應(yīng)用包括分析相間細(xì)胞的多色探針斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，免疫表型，細(xì)胞形態(tài)和dna含量。
該系統(tǒng)正在測(cè)試染色體拷貝數(shù)的畸變，該畸變與總dna含量相關(guān)，并與膀胱腫瘤有關(guān)。在產(chǎn)前研究中，該系統(tǒng)可用于測(cè)試與產(chǎn)前缺陷（包括唐氏綜合癥，特納氏綜合癥，克林費(fèi)爾特氏綜合癥等）相關(guān)的相間核的非整倍性。在細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)研究中，該系統(tǒng)可用于繪制細(xì)胞表面標(biāo)志物（例如受體），細(xì)胞質(zhì)標(biāo)志物（包括細(xì)胞骨架蛋白，信使rna和特定基因）的存在和相對(duì)分布。
診斷潛力在過去的十五年中，研究人員已經(jīng)知道，fish技術(shù)具有巨大的潛力，不僅可以用作純粹的研究工具，而且可以用于產(chǎn)前診斷，細(xì)胞遺傳學(xué)和腫瘤評(píng)估等領(lǐng)域的臨床診斷。缺乏高級(jí)的，價(jià)格適中的系統(tǒng)，不僅減慢了大多數(shù)研究人員使用fish的速度，而且還阻止了該技術(shù)在診斷性醫(yī)療保健環(huán)境中不可避免地?cái)U(kuò)展。
該系統(tǒng)重要的影響之一是它可以提供高級(jí)結(jié)果，而以前只有昂貴的定制配置系統(tǒng)才能提供。在不久的將來，將fish不僅應(yīng)用于更廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用中，而且還可以滿足患者的直接需求的夢(mèng)想可能會(huì)成為現(xiàn)實(shí)。