抽象開(kāi)發(fā)了微型寬視野多光譜內(nèi)窺鏡成像系統(tǒng)，可在寬波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行反射和熒光成像。內(nèi)窺鏡的直徑為0.8mm，可用于小內(nèi)腔（例如輸卵管）的自然孔成像。從250到642 nm的五個(gè)激光器耦合到一個(gè)125 μm直徑的多模光纖，并傳輸?shù)絻?nèi)窺鏡遠(yuǎn)端以進(jìn)行照明。紫外線和藍(lán)色波長(zhǎng)激發(fā)內(nèi)源性熒光團(tuán)，可以為健康和疾病提供不同的熒光發(fā)射圖像。可見(jiàn)波長(zhǎng)提供了可合并用于偽白光成像和導(dǎo)航的反射圖像。成像由300 μm直徑三元透鏡系統(tǒng)連接到3000元光纖。透鏡系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于70度全視角，工作距離從3mm到無(wú)限遠(yuǎn)，并且在纖維束的奈奎斯特截止時(shí)對(duì)比度為40％。測(cè)得的性能特征接近設(shè)計(jì)目標(biāo)。利用內(nèi)窺鏡獲得體模和豬生殖道的示例單色，偽白光和復(fù)合熒光圖像。這項(xiàng)工作表明將高性能多光譜熒光成像系統(tǒng)包裝到微型內(nèi)窺鏡系統(tǒng)中的可行性，該系統(tǒng)可能在癌癥的早期檢測(cè)中具有應(yīng)用。
1.簡(jiǎn)介某些疾病的早期檢測(cè)和診斷受到在深埋器官中獲得高分辨率圖像的能力的限制。例如卵巢癌，這是致命的女性生殖惡性腫瘤。卵巢癌通常表現(xiàn)出非特異性癥狀，目前的篩查方法（體格檢查，經(jīng)陰道超聲，ca-125血液檢查）在大型臨床試驗(yàn)中用于一般人群的年度篩查已被證明不可靠或無(wú)效。由于缺乏明顯的癥狀以及該疾病致命的表型（高級(jí)別漿液性卵巢癌（hgsoc））的特殊自然史，在及早發(fā)現(xiàn)階段以使結(jié)果產(chǎn)生顯著差異是有問(wèn)題的。模型表明，hgsoc存在于一個(gè)隱匿無(wú)癥狀形式為3至4年，其中它太小，通過(guò)分泌的生物標(biāo)記物，磁共振成像，計(jì)算機(jī)斷層掃描來(lái)檢測(cè)，并且可能超聲波，隨后迅速生長(zhǎng)階段在第4至5年出現(xiàn)癥狀時(shí)，此時(shí)腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移并致死。
新興的共識(shí)表明，hgsoc的很大一部分（可能超過(guò)50％）實(shí)際上起源于輸卵管，隨后遷移到卵巢和腹膜。如果這個(gè)假設(shè)是正確的，那么它將通過(guò)使用相對(duì)便宜但堅(jiān)固的光學(xué)組件通過(guò)微創(chuàng)內(nèi)窺鏡對(duì)疾病進(jìn)行早期檢測(cè)打開(kāi)一個(gè)窗口。光學(xué)成像可以對(duì)疾病進(jìn)行定位，并可以在需要侵入性*之前從可疑的血液標(biāo)記物中確認(rèn)診斷。高分辨率光學(xué)技術(shù)可能具有在早期檢測(cè)所需的分辨率水平上產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能信息的能力，但自由空間光學(xué)器件無(wú)法透皮穿透人體并進(jìn)入足夠的深度。光纖和自由空間組件的小型化允許集成到微創(chuàng)內(nèi)窺鏡中。
人體通過(guò)陰道，子宮頸和子宮提供一條自然途徑，以進(jìn)入輸卵管和卵巢。輸卵管的近端輸卵管開(kāi)口位于子宮內(nèi)，口直徑為約1 mm。然后，管子擴(kuò)張到大管內(nèi)直徑為約1 厘米在整個(gè)12至15厘米的曲折路徑中，菌絲將管子連接到子房。以前，簡(jiǎn)單的白光成像內(nèi)窺鏡（稱為輸卵管鏡）的外徑（od）小于一mm，以前已經(jīng)在體內(nèi)對(duì)輸卵管成像，以阻止生育。這些輸卵管鏡是通過(guò)*的工作通道引入的。通過(guò)連接到相干光纖束（cfb）的鏡頭進(jìn)行成像。設(shè)計(jì)用于輸卵管阻塞性*的輸卵管鏡缺乏足夠的成像性能，無(wú)法篩查早期卵巢癌所表現(xiàn)出的細(xì)微變化。
篩檢型輸卵管鏡的導(dǎo)航部分應(yīng)采用寬視野（fov）進(jìn)行前視，并且應(yīng)采用大800 μm od。前視廣角內(nèi)窺鏡具有三種主要技術(shù)，可將圖像從遠(yuǎn)端傳輸?shù)接?jì)算機(jī)：光纖束，微型檢測(cè)器和光學(xué)掃描?，F(xiàn)在，許多現(xiàn)代內(nèi)窺鏡直接在內(nèi)窺鏡中使用微型cmos檢測(cè)器。微型探測(cè)器0.5 mm× 0.5 mm尺寸已被證明和1 mm× 1 mm檢測(cè)器是可商購(gòu)的。隨著技術(shù)的不斷萎縮，它可能是可行的。800 μm od內(nèi)窺鏡，但當(dāng)前不是一個(gè)選擇。諸如壓電掃描光纖（sf）內(nèi)窺鏡之類的掃描技術(shù)也在繼續(xù)縮小。1.2 mm的實(shí)現(xiàn)方式已用于對(duì)1 cm的遠(yuǎn)端輸卵管進(jìn)行體內(nèi)成像。該技術(shù)具有明顯的光學(xué)優(yōu)勢(shì)和有效的像素密度，但需要進(jìn)一步的小型化才能進(jìn)一步插入輸卵管。的前視內(nèi)窺鏡成像技術(shù)使用cfb。內(nèi)窺鏡中的透鏡將圖像成像到cfb的遠(yuǎn)端表面上，然后在體外分離成像系統(tǒng)將cfb的近端圖像成像到檢測(cè)器上。對(duì)于亞mm直徑的內(nèi)窺鏡，cfb方法仍然是可行的技術(shù)，但是與任何攝像頭系統(tǒng)一樣，在fov和分辨率之間需要權(quán)衡。輸卵鏡的有限尺寸限制了cfb像素的數(shù)量，從而損害了以接近細(xì)胞分辨率同時(shí)執(zhí)行廣域?qū)Ш降哪芰ΑＨ欢?br>熒光成像可用于可視化組織化學(xué)成分的變化，非常適合于寬視場(chǎng)成像。特別是內(nèi)源性熒光團(tuán)（*，膠原蛋白，*腺嘌呤二核苷酸+氫等）在正常和異常組織中的濃度可能不同。使用紫外線和短波可見(jiàn)光激發(fā)源，可以在組織中激發(fā)不同的熒光團(tuán)。正常，良性和癌性卵巢組織之間的內(nèi)源性熒光差異已由研究人員和其他人使用光纖探針在體內(nèi)和離體進(jìn)行了表征和廣域自發(fā)熒光成像。多光譜熒光成像（mfi）可以在反射率和熒光模式下成像，以測(cè)量光吸收或熒光發(fā)射，這兩者都可以指示分子變化（血紅蛋白或熒光團(tuán)濃度的變化）或組合多個(gè)反射率圖像用于偽白光成像。
先前已經(jīng)證明了雙模態(tài)光學(xué)相干斷層掃描（oct）和熒光成像內(nèi)窺鏡。阿2.1-mm直徑的sf內(nèi)窺鏡外源熒光團(tuán)的多光譜熒光成像已經(jīng)證實(shí)沒(méi)有uv激發(fā)或oct能力。初步研究在使用1.2mmsf內(nèi)窺鏡對(duì)輸卵管進(jìn)行體內(nèi)白光成像方面取得的成功有限。較大直徑的裝置難以穿過(guò)管子。直徑為幾百微米的側(cè)視式探針也已被證明僅使用oct并使用雙包層光纖進(jìn)行oct和單點(diǎn)熒光檢測(cè)。直徑為幾mm的其他內(nèi)窺鏡將熒光成像和oct的各種實(shí)現(xiàn)方式結(jié)合在一起。這些示例均未將寬視野熒光成像和oct組合到亞mm直徑的包裝中。此外，這些示例均未包含將mfi用于廣域自發(fā)熒光檢測(cè)的uv激發(fā)。
使內(nèi)窺鏡使用的寬視野mfi小型化是驗(yàn)證該技術(shù)在體內(nèi)使用的下一步。在本文中，我們描述了小型mfi系統(tǒng)的光學(xué)設(shè)計(jì)和表征，以及將其集成到微型系統(tǒng)中的過(guò)程。800 μm直徑輸液鏡原型。
2.設(shè)計(jì)與方法2.1.光學(xué)設(shè)計(jì)mfi光學(xué)設(shè)計(jì)由四個(gè)具有獨(dú)立且相互關(guān)聯(lián)的規(guī)格的光學(xué)子系統(tǒng)組成（圖1）。遵循光的路徑，四個(gè)光學(xué)子系統(tǒng)分別是：近端照明，遠(yuǎn)端照明，遠(yuǎn)端成像和近端成像。為了有效導(dǎo)航，全視場(chǎng)（ffov）的總體系統(tǒng)規(guī)格為70度。根據(jù)以前的研究，包括的照明波長(zhǎng)為250、375、406、515和642 nm。激光源用于內(nèi)窺鏡原型，其中心波長(zhǎng)與我們先前對(duì)離體卵巢和輸卵管組織的mfi成像研究中的過(guò)濾氙弧燈提供的中心波長(zhǎng)相似。紫外線和藍(lán)色波長(zhǎng)可有效激發(fā)內(nèi)源性熒光團(tuán)。在反射模式下以375、406和515 nm采樣血液吸收曲線也可以提供診斷工具。后，通過(guò)獲取并組合具有406、515和642 nm照明波長(zhǎng)的圖像序列，可以獲得偽白光成像。包括250 nm光在內(nèi)的寬光譜范圍以及執(zhí)行反射率和熒光成像的要求都需要單獨(dú)的激發(fā)和照明通道。成像通道針對(duì)375至642 nm的成像進(jìn)行了優(yōu)化。因此，250-nm照明僅用于熒光模式，但是所有其他照明波長(zhǎng)都可以用于反射率或熒光模式。為了適應(yīng)大外徑為的柔性內(nèi)窺鏡的集成800 μm，照明和成像通道限制為125 - 300 μm直徑。套圈，拉線和保護(hù)套所需的剩余空間。具有類似機(jī)械設(shè)計(jì)但不具有mfi功能的內(nèi)窺鏡的機(jī)械和操縱細(xì)節(jié)已在之前發(fā)布。但是，設(shè)計(jì)確實(shí)允許125 μm直徑的管腔，用于將來(lái)的其他功能，而又不超過(guò)總外徑的要求。
圖1
內(nèi)窺鏡mfi系統(tǒng)概述。左上方顯示了將五激光束組合到照明光纖（if）中的近端照明系統(tǒng)。左下方顯示了通過(guò)顯微鏡物鏡（obj.），濾光輪（fw）成像到檢測(cè)器（det.）上的cfb近端表面成像的近端照明系統(tǒng)。右邊是遠(yuǎn)端的放大模型，其頂部顯示錐形if，底部顯示cfb的成像鏡頭，兩者均與套圈的遠(yuǎn)端齊平。未顯示保護(hù)蓋板。
2.1.1.近照度接近地，五激光束被準(zhǔn)直，共對(duì)準(zhǔn)并聚焦到照明光纖（if）中。這兩個(gè)紫外線波長(zhǎng)是由前面所述的脈沖，倍頻和三倍變綠變石激光器產(chǎn)生的。406、515和642nm波長(zhǎng)由單模尾纖二極管激光器（型號(hào)：lp406-sf20，lp520-sf15和lp642-sf20，thorlabs，newton，new jersey）提供，每個(gè)激光器均帶有一個(gè)溫度控制二極管驅(qū)動(dòng)程序（cld1010lp，thorlabs）。每個(gè)可見(jiàn)光激光器均通過(guò)可調(diào)聚焦準(zhǔn)直儀（cfc-11x-a，thorlabs）進(jìn)行準(zhǔn)直。使用一系列四個(gè)二向色鏡（型號(hào)：zt594rdc，zt488rdc，zt375rdc，chroma technology corp，貝婁瀑布，佛蒙特州和型號(hào)ff310-dio1，semrock inc.，羅徹斯特，紐約）組合光束。642 nm激光是參考光束，并穿過(guò)所有二向色鏡。使用透射較長(zhǎng)波長(zhǎng)并反射較短波長(zhǎng)的二向色鏡，將每個(gè)隨后的較短波長(zhǎng)與紅光束共對(duì)準(zhǔn)，從而在第四分色鏡之后，將所有五激光束共對(duì)準(zhǔn)。
然后，將同心的光束路徑聚焦到if中。根據(jù)直徑和高的uv到vis透射要求，所使用的if是具有0.22數(shù)值孔徑（na）的高oh硅纖芯光纖（fip100110125，polymicro，亞利桑那州鳳凰城），100 μm核心和od 125 μm。沒(méi)有檢測(cè)到來(lái)自中頻的自發(fā)熒光，這會(huì)降低系統(tǒng)信噪比。主耦合透鏡是一對(duì)未鍍膜的平凸20 mm焦距氟化鈣透鏡（la5315，thorlabs）。使用一對(duì)透鏡而不是單個(gè)透鏡提供了兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)，但代價(jià)是一個(gè)缺點(diǎn)。裂隙透鏡可顯著降低球面像差，這是將激光聚焦到透鏡上所必需的。100 μm芯纖維。此外，直徑4至4.5mm的激光束需要有效焦距為約10 mm以匹配0.22-na光纖鏡頭對(duì)的有效焦距為9.8mm，焦距為20mm的鏡頭很容易就可以買到，而等效的單鏡頭則沒(méi)有。但是，由于光譜范圍較寬，所以這些透鏡沒(méi)有鍍膜，因此使用一對(duì)透鏡會(huì)增加菲涅耳反射的損耗。盡管氟化鈣的色散較低，但這些鏡片仍需要進(jìn)行縱向色差校正。375 nm光束的焦點(diǎn)位置用作參考焦點(diǎn)距離?？梢?jiàn)光束上的可調(diào)焦點(diǎn)準(zhǔn)直器有效地用作弱正透鏡，以獨(dú)立地將每個(gè)可見(jiàn)光束焦點(diǎn)與375 nm光束焦點(diǎn)匹配。通過(guò)放置負(fù)200mm防紫外線鍍膜的熔融石英透鏡（250-325，edmund optics，barrington，分光鏡之前的光束路徑中。假設(shè)光束直徑為4.5mm，則該設(shè)計(jì)理論上將所有五個(gè)光束聚焦到同一位置，且均方根半徑在5.5至15.5 μm并匹配if。100 μm核心，將22-na光纖放置在焦點(diǎn)上方，以耦合光而不會(huì)損壞光纖表面。這種簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)使用廉價(jià)的球面光學(xué)器件將激光耦合到if中，可以提供足夠的性能和合理的傳輸。使用單涂層非球面鏡可以實(shí)現(xiàn)出色的透射率。
2.1.2.遠(yuǎn)端照明遠(yuǎn)端照明必須*照亮遠(yuǎn)端成像物鏡成像的ffov。具有必需光譜傳輸范圍和od的多模光纖無(wú)法提供足夠的na來(lái)照亮70度f(wàn)fov。因此，if遠(yuǎn)側(cè)輸出照明角度需要修改。if與成像光軸不同軸，因此照明角度必須略大于70度成像場(chǎng)。因此，期望的輸出na至少為0.6，對(duì)應(yīng)于73.7度的照明ffov。光纖的光闌大致恒定，這意味著隨著光纖輸出面的面積減小，輸出na可以增加。減少纖維表面積36.7 μm直徑將輸出na增加到0.6。光纖的末端是錐形的，以滿足該規(guī)格。
原型設(shè)計(jì)目前在照明或成像光纖上均不包括蓋板。初步分析表明，在照明和成像通道上方使用單蓋板將導(dǎo)致if離開(kāi)蓋板的背反射進(jìn)入照明na大于0.25的成像通道。對(duì)于臨床設(shè)備，光通道將需要保護(hù)。這可以通過(guò)為照明和成像通道使用單獨(dú)的蓋板或?yàn)閕f使用帶有突出通道的單蓋板來(lái)完成。
2.1.3.遠(yuǎn)端影像為了在輸卵管和卵巢表面提供良好的導(dǎo)航性能，遠(yuǎn)端成像鏡頭設(shè)計(jì)必須成像70度f(wàn)fov并具有長(zhǎng)焦距。另外，鏡片必須成像375至642 nm的寬光譜范圍，以獲取熒光和反射率圖像。從物理上講，鏡頭設(shè)計(jì)僅限于300 μm直徑元素具有合理的厚度和曲率，以降低制造和施工復(fù)雜性。
終的光學(xué)設(shè)計(jì)是定制的三元素鏡片（圖2），然后將其成像到具有3000個(gè)元素的cfb（fujikura figh-03-215s）。從遠(yuǎn)端到近端，鏡片元件材料為s-fpm3，s-fpl51y和藍(lán)寶石。為了進(jìn)行初步的概念驗(yàn)證，未鍍膜鏡片。cfb的涂層直徑為285 μm，圖像圓直徑190 μm，0.4 na和典型的3.1芯至芯間距3.4 μm。對(duì)于小于390 nm的波長(zhǎng)，光的衰減會(huì)顯著增加，但在375 nm處，內(nèi)窺鏡所需的大長(zhǎng)度為幾米。cfb中的元素?cái)?shù)量從根本上限制了系統(tǒng)的空間分辨率。在過(guò)去的生育力內(nèi)窺鏡中，具有3000個(gè)元素的cfb在輸卵管中提供了足夠的圖像分辨率。
圖2
定制三元件遠(yuǎn)端成像鏡頭。縮小視圖（底部）顯示了在5mm的標(biāo)稱工作距離（wd）時(shí)的6.38mm ffov。鏡頭總長(zhǎng)度為0.88mm，鏡頭外徑為0.3mm。還顯示了聚焦在cfb上的鏡頭的放大圖（頂部）。cfb（藍(lán)色）的像圈直徑為0.19mm。
小值3.1 μm cfb的磁芯間距對(duì)應(yīng)于大奈奎斯特截止頻率161 次/ mm。終的鏡頭設(shè)計(jì)是f/ 2.4并在cfb的奈奎斯特截止點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)40％調(diào)制傳遞函數(shù)（mtf）對(duì)比度，用于多色成像，對(duì)70度f(wàn)fov范圍內(nèi)的所有光線以及從3 mm到無(wú)限遠(yuǎn)的所有工作距離進(jìn)行多色成像。在范圍之外時(shí)，對(duì)于短至1.2 mm的工作距離，對(duì)比度保持在30％以上。在光纖的頻率截止處，mtf對(duì)比度高于20％應(yīng)該足以成像。鏡頭設(shè)計(jì)有額外的性能緩沖器，以解決下面討論的對(duì)準(zhǔn)公差。圖中顯示了標(biāo)稱工作距離為5 mm時(shí)設(shè)計(jì)的多色mtf。圖3。在大多數(shù)情況下，該透鏡將用于成像單波長(zhǎng)反射率或特定的熒光發(fā)射帶，而不是整個(gè)設(shè)計(jì)波長(zhǎng)范圍。在這些情況下，mtf得到了進(jìn)一步的改進(jìn)，因?yàn)樵S多降級(jí)都來(lái)自整個(gè)光譜范圍內(nèi)的色差?？梢栽诿總€(gè)波長(zhǎng)處對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，以便在融合進(jìn)行分析時(shí)可以對(duì)在不同波長(zhǎng)帶處順序采集的圖像進(jìn)行數(shù)字色彩校正。
三元件透鏡設(shè)計(jì)的多色mtf，工作距離為5 mm。垂直軸是光學(xué)傳遞函數(shù)的模量，水平軸是空間頻率，以每mm周期為單位。光纖束的小芯對(duì)芯間距對(duì)應(yīng)于大頻率截止約160mm。
普通的安裝和對(duì)準(zhǔn)技術(shù)幾乎不可能以微型規(guī)模實(shí)現(xiàn)，而需要以適度的結(jié)構(gòu)對(duì)準(zhǔn)公差來(lái)維持足夠的成像性能。假定這些元素的大半徑和厚度偏差為30 μm，球形和散光不規(guī)則度為0.2條紋，折射率誤差為0.001，阿貝偏差為1％。確定建筑公差為大30 μm所有元素在任一軸上的偏心距和1度傾斜角度。使用這些參數(shù)在5 mm的額定工作距離和450 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行了1000次運(yùn)行的monte carlo靈敏度分析。測(cè)得的性能標(biāo)準(zhǔn)是頻率截止時(shí)的平均mtf161 次/ mm，其標(biāo)稱值為0.629。如果沒(méi)有任何焦點(diǎn)補(bǔ)償，則耐受后的平均mtf預(yù)計(jì)為0.597，其中90％的試驗(yàn)超過(guò)0.554。換句話說(shuō)，即使具有適度的結(jié)構(gòu)公差，頻率截止處的平均對(duì)比度也有望下降< 8 ％ 在超過(guò)90％的建筑中< 3 ％在超過(guò)50％的版本中。因此，在構(gòu)造之后，透鏡系統(tǒng)應(yīng)保持足夠的成像性能，直至光纖的截止頻率。
該設(shè)計(jì)優(yōu)先考慮校正球差，彗差，軸向色度和像散?；兪秋@著的剩余像差，其次是場(chǎng)曲和橫向顏色。這些像差是可以接受的，因?yàn)樵趯?duì)輸卵管內(nèi)部的非平面幾何成像時(shí)，分辨率（以及檢測(cè)能力）比忠實(shí)再現(xiàn)平坦均勻的場(chǎng)域更為重要。每個(gè)單獨(dú)的圖像使用單個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)和窄發(fā)射帶。因此，橫向顏色將不是每個(gè)圖像中的問(wèn)題，而是可以用用于合成圖像組合的軟件進(jìn)行校正的問(wèn)題。失真不會(huì)降低圖像清晰度，并且對(duì)于寬70度f(wàn)fov是可以接受的折衷方案。另一個(gè)設(shè)計(jì)功能包括圖像空間遠(yuǎn)心，190 μm匹配cfb。
鏡頭中的三個(gè)元素是堆疊的，并且僅包含兩個(gè)的非平面表面。堆疊設(shè)計(jì)使透鏡可以掉入套圈的mfi成像通道中，并通過(guò)光纖束向近端固定，并通過(guò)蓋板向遠(yuǎn)側(cè)固定，從而簡(jiǎn)化了結(jié)構(gòu)。通過(guò)簡(jiǎn)化構(gòu)造和制造測(cè)試，僅使用兩個(gè)的非平面曲率可降低成本。鏡頭組件的長(zhǎng)度為0.88mm，留有足夠的空間將cfb固定在鏡頭后方3mm長(zhǎng)的套圈中。預(yù)期該剛性長(zhǎng)度不會(huì)損害曲折解剖結(jié)構(gòu)中的跟蹤和導(dǎo)航。
2.1.4.近端成像纖維束的近端面用改良的顯微鏡成像。無(wú)限校正，紫外線增強(qiáng)，20×物鏡（uapo/340 20×/0.75)（日本東京奧林巴斯）與焦距為151.5mm的紫外線校正消色差管透鏡（027-3025，optosigma，圣安娜，加利福尼亞）一起使用。奧林巴斯的物鏡放大倍數(shù)是在假定焦距為180 mm的套筒透鏡的情況下的。焦距較短的套筒透鏡會(huì)導(dǎo)致整體放大倍率降低20×至16.8×。該探測(cè)器（新澤西州阿克頓市普林斯頓儀器公司的pixis 1024）具有13 × 13 μm像素的典型單像素阱深度為100 ke-。在此配置中，3.1 μmcfb的芯到芯間距為52.2 μm在對(duì)應(yīng)的檢測(cè)器上?四每個(gè)核心到核心間隔的檢測(cè)器像素，超過(guò)了奈奎斯特采樣要求。在物鏡和管透鏡之間的無(wú)窮大空間中，可以使用10位置濾光輪（fw）（lb10w-3985，薩特儀器，加利福尼亞州諾瓦托）選擇特定的發(fā)射帶進(jìn)行熒光成像，或者在開(kāi)放位置允許反射成像。濾波器位置之間的小切換時(shí)間為55 ms。
2.2.圖像處理使用winview（princeton instruments）將圖像記錄為16位灰度圖像。使用圖像分析軟件（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院imagej）和matlab（馬薩諸塞州內(nèi)蒂克的mathworks）對(duì)單個(gè)圖像進(jìn)行處理。對(duì)于所有圖像，將纖維束圖像圓以外的像素值設(shè)置為0。對(duì)圖像圓內(nèi)的像素進(jìn)行對(duì)比度增強(qiáng)，以將亮的1％像素和暗的1％像素分別設(shè)置為大和小強(qiáng)度價(jià)值觀。增強(qiáng)對(duì)比度后，通過(guò)在不降低分辨率的情況下減輕cfb的像素化效果，應(yīng)用輕微的高斯模糊以增加視覺(jué)感知。通過(guò)將藍(lán)色通道的406 nm照明，綠色通道的515 nm照明和紅色通道的642 nm照明進(jìn)行加權(quán)組合來(lái)創(chuàng)建顏色反射率圖像。定性地調(diào)整每個(gè)通道的權(quán)重，以匹配對(duì)準(zhǔn)確色彩再現(xiàn)的感知。彩色熒光圖像使用從窄帶450-，532-和590-nm發(fā)射濾光片收集的光。所有發(fā)射濾光片的全寬近似大值為10 nm。通過(guò)組合三個(gè)發(fā)射濾鏡圖像并定性加權(quán)通道以近似視覺(jué)顏色強(qiáng)度來(lái)創(chuàng)建合成圖像。
2.3.成像系統(tǒng)測(cè)試對(duì)mfi成像系統(tǒng)的分辨率和視野進(jìn)行了表征，并與理論仿真進(jìn)行了比較。另外，評(píng)估了成像系統(tǒng)產(chǎn)生偽白光圖像和捕獲熒光圖像的能力。
2.3.1.成像分辨率測(cè)試將成像透鏡參數(shù)和近似纖維束參數(shù)建模為一個(gè)完整的系統(tǒng)（成像儀，五個(gè)焦距，博爾德，科羅拉多州），以確定在1、3、5、7和10 mm的工作距離處的預(yù)期小可分辨特征尺寸和fov 。
對(duì)于每個(gè)工作距離，已構(gòu)造的內(nèi)窺鏡對(duì)在目標(biāo)中心和邊緣的usaf測(cè)試目標(biāo)上的條形目標(biāo)進(jìn)行成像。用白光對(duì)測(cè)試目標(biāo)進(jìn)行透射照明，并且無(wú)需發(fā)射濾鏡即可獲得灰度圖像。如上所述，以1.4像素的高斯模糊半徑對(duì)所得圖像進(jìn)行處理。
通過(guò)在每個(gè)位置的分辨率截止點(diǎn)附近對(duì)一系列條形目標(biāo)進(jìn)行成像，可以在軸上和視野邊緣評(píng)估分辨率。視場(chǎng)的邊緣被認(rèn)為是半徑的十分之九，以使條形目標(biāo)合理地適合于fov。在每個(gè)目標(biāo)的水平和垂直條上繪制一個(gè)代表性的輪廓，并測(cè)量調(diào)制頻率。兩點(diǎn)的瑞利分辨率標(biāo)準(zhǔn)峰強(qiáng)度和谷強(qiáng)度之間的下降26.4％。調(diào)制對(duì)比度由以下公式給出：
調(diào)制對(duì)比度=(imax−imin)imax+imin.
因此，瑞利標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)于15.21％的調(diào)制對(duì)比度。垂直和水平條的調(diào)制對(duì)比度都大于或等于15.21％的條目標(biāo)被認(rèn)為是可分辨的。對(duì)于每個(gè)工作距離，將小可分辨條的寬度與建模的小可分辨特征尺寸進(jìn)行比較。
白光照明下的測(cè)試應(yīng)提供與多色mtf類似的結(jié)果圖3。實(shí)際上，該系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為主要對(duì)窄帶熒光或反射率成像。cfb的頻率截止從根本上限制了任何給定工作距離下的大分辨率。但是，窄帶成像將減少色差，從而在cfb的頻率截止處（特別是在離軸高頻時(shí)）增加mtf。因此，在窄帶成像配置中，分辨率不會(huì)提高，但是對(duì)比度和圖像質(zhì)量可能會(huì)提高。
2.3.2.成像視場(chǎng)測(cè)試通過(guò)在每個(gè)工作距離以每mm一個(gè)線對(duì)的方波對(duì)成像進(jìn)行成像，來(lái)測(cè)量所構(gòu)造的內(nèi)窺鏡的fov。用白光對(duì)目標(biāo)進(jìn)行透射照明，并且無(wú)需發(fā)射濾鏡即可獲得灰度圖像。這些線對(duì)用于在每個(gè)工作距離處測(cè)量以mm為單位的近似fov，并將其與模擬值進(jìn)行比較。
2.3.3.熒光標(biāo)準(zhǔn)成像內(nèi)窺鏡對(duì)熒光成像的能力通過(guò)對(duì)磺基若丹明，熒光素和硫酸奎寧（表格1）。穩(wěn)定且特性良好的染料是測(cè)試的理想選擇。它們?cè)谂c生物軟組織相似的波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)出熒光，并被稀釋為強(qiáng)度類似于組織自發(fā)熒光的熒光。三個(gè)比色皿并排放置，并且五色照明激光束旨在穿過(guò)所有三個(gè)樣品瓶。將成像內(nèi)窺鏡垂直于激光束放置，以便可以對(duì)每個(gè)小瓶?jī)?nèi)的激光束路徑成像。對(duì)于除642 nm以外的每個(gè)照明波長(zhǎng)，使用窄帶發(fā)射濾光片分別在450、532和590 nm處記錄了三幅圖像。在沒(méi)有發(fā)射濾光片的情況下記錄了第四張圖像。如上所述處理圖像。使用過(guò)濾后的圖像創(chuàng)建了定性的復(fù)合彩色圖像。對(duì)于合成彩色圖像，590-nm濾光片圖像映射到十六進(jìn)制feb900給出的橙色，以匹配熒光信號(hào)的視覺(jué)感知。450和532 nm圖像分別映射到藍(lán)色和綠色通道。
表格1用于測(cè)試的熒光染料及其濃度和溶解溶劑。
染料 溶劑 濃度 （μm）
sr 乙醇 0.8
qs 50 h2so4 2
fl 0.1 m氫氧化鈉 0.2
注意：sr，磺基若丹明；qs，硫酸奎寧；f1，熒光素。
3.結(jié)果3.1.成像分辨率和視野在3至10 mm的工作距離范圍內(nèi)，測(cè)得的小可分辨特征尺寸與模型值相比具有優(yōu)勢(shì)（圖4）。圖中顯示了3、5和10 mm的軸上鋼筋目標(biāo)測(cè)試的樣本圖像圖5。在1mm的工作距離上，內(nèi)窺鏡幾乎無(wú)法在軸上分辨測(cè)試目標(biāo)上的小條形（第3組，元素6）。根據(jù)mtf的預(yù)期，在所有工作距離下的離軸性能都比在軸上差。在與分辨率相同的工作距離下測(cè)量fov。它始終比模型值小一些，如圖4。
在1、3、5、7和10 mm的工作距離下，測(cè)得的分辨率和fov與建模值進(jìn)行了比較。
圖5
來(lái)自軸分辨率測(cè)試的樣本圖像。左側(cè)的圖像是所使用的1951 usaf測(cè)試目標(biāo)的數(shù)碼相機(jī)圖像。以下從左到右的三幅圖像是使用內(nèi)窺鏡在3、5和10 mm的工作距離處獲取的測(cè)試目標(biāo)的圖像。小可分辨特征分別確定為第3組元素1，第2組元素3和第1組元素5。
3.2.熒光成像可以看到熒光素，硫酸奎寧和磺基羅丹明的成像結(jié)果。圖6染料的吸收特性在表2。由于占終圖像強(qiáng)度的重要變量包括照明功率和帶寬，照明光吸收，熒光團(tuán)量子產(chǎn)率和濃度，熒光發(fā)射光譜，發(fā)射濾光片光譜，光學(xué)系統(tǒng)光譜響應(yīng)和圖像處理，因此該圖不是定量的。在每個(gè)照明波長(zhǎng)處染料的熒光強(qiáng)度的定性比較與基于近似量子產(chǎn)率的預(yù)測(cè)非常吻合。發(fā)射濾光片還成功地阻擋了帶外照明光，該可見(jiàn)光在沒(méi)有可見(jiàn)光濾光片的情況下可以在圖像中看到。
表2每種熒光染料的吸收和發(fā)射特性。對(duì)于每種照射波長(zhǎng)，給出了每種染料的吸收百分比。將每種染料的百分比歸一化，以使峰值吸收波長(zhǎng)為100％。還提供了發(fā)射光譜的峰值波長(zhǎng)和光譜寬度的一半大值。
染料
sr qs fl
吸收率（％）
250納米 14.5 100.0 29.1
375納米 5.3 15.1 1.6
406納米 1.5 0.4 1.8
515納米 9.5 0.0 13.1
發(fā)射（nm）
峰值 593 449 515
fwhm 34 94 38
注意：sr，磺基若丹明；qs，硫酸奎寧；f1，熒光素。
圖6
1厘米寬比色皿中的熒光染料圖像。從左到右，比色皿包含磺基若丹明，硫酸奎寧和熒光素。圖像的每一行對(duì)應(yīng)于所使用的四個(gè)照明波長(zhǎng)之一。左邊的一列是用數(shù)碼相機(jī)拍攝的圖像。白色圓圈代表內(nèi)窺鏡的近似fov。從左至右，中間的四列是使用不帶450納米，532納米和590納米發(fā)射濾光片的內(nèi)窺鏡拍攝的圖像。右邊的一欄是450、532和590 nm發(fā)射濾光片圖像的彩色合成圖像。
3.3.彩色影像為了測(cè)試rgb成像模式，使用可見(jiàn)光光源對(duì)彩色物體進(jìn)行了連續(xù)成像，并使用imagej將反射率圖像合成為彩色合成物。圖7在名片上顯示了亞利桑那大學(xué)徽標(biāo)的彩色合成圖像，該圖像忠實(shí)再現(xiàn)了飽和的紅色和藍(lán)色。還通過(guò)對(duì)豬的卵巢和輸卵管組織進(jìn)行切片成像來(lái)測(cè)試彩色熒光成像（圖7）。該組織是從亞利桑那州的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的方式從當(dāng)?shù)氐耐涝讏?chǎng)獲得的。用375 nm的光照射組織，并使用450、532和642 nm的發(fā)射濾光片對(duì)其進(jìn)行連續(xù)成像。然后將三個(gè)熒光圖像合并為合成彩色圖像。
左圖是使用數(shù)碼相機(jī)拍攝的，并且是（a）名片上的亞利桑那大學(xué)徽標(biāo)，以及（c）包括生殖腔，卵泡和輸卵管的豬生殖系統(tǒng)的一部分（左上）。內(nèi)窺鏡拍攝的相應(yīng)圖像在右側(cè)，fov由覆蓋在左側(cè)圖像上的圓圈近似。圖像b是通過(guò)依次獲取405、515和642 nm照明的圖像而拍攝的合成色反射圖像。圖像d是使用375 nm激發(fā)創(chuàng)建的合成彩色熒光圖像，并使用450、532和590 nm發(fā)射濾光器順序采集圖像。
4.討論已經(jīng)建立了一種微型*，該系統(tǒng)能夠使用紫外線和可見(jiàn)光進(jìn)行自發(fā)熒光或偽白光成像模式進(jìn)行大范圍導(dǎo)航。*構(gòu)造的內(nèi)窺鏡集成300 μm直徑的鏡頭和獨(dú)立的照明通道成一個(gè)790 μm od包，用于人類輸卵管。寬視場(chǎng)，在大景深范圍內(nèi)具有良好的成像性能，是導(dǎo)航的理想選擇。與標(biāo)準(zhǔn)白光相機(jī)相比，執(zhí)行自發(fā)熒光成像的功能可以提高對(duì)癌癥的敏感性。在規(guī)定的尺寸范圍內(nèi)以及在所需的波長(zhǎng)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)成像規(guī)格提出了重大挑戰(zhàn)，但是，演示的原型能夠滿足規(guī)格要求，并具有模塊化，靈活的設(shè)計(jì)，可用于將來(lái)的內(nèi)窺鏡。
小型且柔性的內(nèi)窺鏡可以被修改以用于其他應(yīng)用，例如通過(guò)小口徑皮下注射針插入。內(nèi)窺鏡的機(jī)械設(shè)計(jì)具有轉(zhuǎn)向功能以及其他功能125 μm內(nèi)腔具有其他功能，例如高分辨率oct成像?？梢远ㄖ普彰飨到y(tǒng)，以根據(jù)應(yīng)用需要包括從250 nm到可見(jiàn)光譜的任何激光波長(zhǎng)。也可以將近紅外照明合并到系統(tǒng)中，但是如果與250 nm照明一起使用，則可能需要定制二向色鏡涂層。設(shè)計(jì)用于反射250 nm并透射更長(zhǎng)波長(zhǎng)的現(xiàn)成二向色鏡通常在近紅外中具有高透射損耗。專門(mén)執(zhí)行熒光成像的系統(tǒng)可能能夠?qū)⒄彰骱统上窠M合成單個(gè)路徑，從而獲得更小的尺寸。但是，在單路徑配置中，uv照明波長(zhǎng)將受到cfb衰減的限制。
當(dāng)暴露在紫外線照射下時(shí)，成像鏡頭和套圈材料不會(huì)顯示熒光。組織自發(fā)熒光信號(hào)通常非常低，并且來(lái)自材料的任何其他熒光都會(huì)將信噪比降低到不可接受的水平。目前，此要求消除了用于注塑，3-d打印，金剛石車削或grin材料的塑料或聚合物。紫外線波長(zhǎng)要求也限制了近端成像系統(tǒng)。假設(shè)具有合理的紫外線透射率的cfb可用，那么將cfb的表面中繼到檢測(cè)器的系統(tǒng)將需要的顯微鏡物鏡和管形透鏡才能在340 nm以下透射。當(dāng)在更寬的光譜范圍內(nèi)成像時(shí)，色差和檢測(cè)器光譜響應(yīng)范圍可能是其他問(wèn)題。
在內(nèi)窺鏡達(dá)到模擬分辨率時(shí)，fov小于預(yù)期。差異可能是由于多種原因造成的?？赡艿脑蚴莄fb的圖像圈大小。它被為190 + 20 μm。鏡頭設(shè)計(jì)為遠(yuǎn)心影像空間。此功能可地減小cfb的入射角依賴性，并在整個(gè)圖像上提供均勻的照明。遠(yuǎn)心度還意味著70度視場(chǎng)旨在成像到190 μm直徑圓。因此，在5mm的工作距離處，預(yù)期的ffov為7.22mm（66度）。如果圖像圓縮小到170 μm直徑，則成像的ffov將為5.72mm（58度），而210 μm圖像圓將對(duì)應(yīng)于7.91mm（75度）的ffov。在5mm的工作距離處測(cè)得的ffov為6mm，在公差范圍內(nèi)。纖維束圖像圓直徑的變化將在分辨率上進(jìn)行權(quán)衡。光纖的數(shù)量保持恒定，因此較小的像圈將減少光纖的平均芯到芯間距，從而提高分辨率。這與針對(duì)建模分辨率的良好測(cè)量結(jié)果是一致的，并且可以解釋在10mm工作距離下優(yōu)于建模分辨率的性能。鏡頭的理論性能設(shè)計(jì)過(guò)高，因此，對(duì)準(zhǔn)良好的鏡頭系統(tǒng)仍將光纖限制為像圈尺寸為220 μm，對(duì)應(yīng)于5mmwd（80度）下的8.65mmffov。較大的視場(chǎng)將開(kāi)始被的晶狀體的邊緣夾住，這可能會(huì)導(dǎo)致不希望的雜散光反射。可能導(dǎo)致ffov降低的其他因素是透鏡對(duì)準(zhǔn)和透鏡制造公差。
內(nèi)窺鏡的終目標(biāo)是用作檢測(cè)卵巢癌和其他可通過(guò)小直徑管腔（例如胰管或膽管）到達(dá)的組織中其他疾病的有效篩選方法。實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)是一個(gè)多步驟的過(guò)程。此處介紹的代內(nèi)窺鏡成功證明了mfi成像可以小型化，從而可以在亞視中提供廣域功能成像。800 μm直徑包裝。下一步是改進(jìn)設(shè)計(jì)，以便可以快速可靠地構(gòu)建堅(jiān)固的內(nèi)窺鏡，以在有限的人體試驗(yàn)中提供安全的實(shí)時(shí)成像。第二代系統(tǒng)的光學(xué)工程挑戰(zhàn)是簡(jiǎn)化，縮小和自動(dòng)化近端光學(xué)系統(tǒng)。
為了在手術(shù)環(huán)境中使用，內(nèi)窺鏡需要堅(jiān)固且可消毒，而近端系統(tǒng)則需要緊湊且便攜以便集成到手術(shù)車中。以前一直缺乏簡(jiǎn)單，緊湊的紫外線源，特別是對(duì)于短于315 nm的波長(zhǎng)。當(dāng)前原型中的uv波長(zhǎng)由內(nèi)部定制的大型激光器提供。盡管光束質(zhì)量足以傳送緊湊光纖的uv-b和uv-c光源仍然難以實(shí)施，但二極管和dpss激光器以及l(fā)ed技術(shù)的發(fā)展已使緊湊，堅(jiān)固，低功率的uv-a光源成為可能。一個(gè)現(xiàn)實(shí)。現(xiàn)在可以構(gòu)建一個(gè)非常緊湊的光源，其波長(zhǎng)范圍從近紫外線到近紅外。一些較新的光源允許足夠短的開(kāi)/關(guān)調(diào)制，從而可以通過(guò)計(jì)算機(jī)輕松地自動(dòng)化捕獲與每個(gè)照明波長(zhǎng)的探測(cè)器采集同步的圖像序列的過(guò)程。
近端成像光學(xué)系統(tǒng)目前使用具有10位高速fw的改進(jìn)型顯微鏡支架。該設(shè)計(jì)允許快速更換發(fā)射濾光片，以使用原型設(shè)備優(yōu)化波長(zhǎng)組合，而以實(shí)時(shí)成像為代價(jià)。手術(shù)過(guò)程中出現(xiàn)的理想圖像組合需要婦科醫(yī)生的進(jìn)一步發(fā)展。一旦確定了理想的濾光帶，就可以使用原型系統(tǒng)構(gòu)建針對(duì)實(shí)時(shí)成像優(yōu)化的第二代近端成像系統(tǒng)。
例如，圖7（d）（豬假色熒光）需要三幅圖像，每幅圖像都要經(jīng)過(guò)60秒的曝光才能使用窄帶（約10 nm fwhm）發(fā)射濾鏡。先前在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的體外mfi組織成像研究成功地使用了帶寬為35至100 nm的發(fā)射濾光片。用市售的高透射率代替干涉濾光片50 +納米帶寬的濾光片將使近端系統(tǒng)的光收集效率提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。通過(guò)將fw和單色檢測(cè)器替換為能夠同時(shí)成像所有波長(zhǎng)帶的快照多光譜成像相機(jī)，可以實(shí)現(xiàn)成像速度的另一個(gè)數(shù)量級(jí)增益。購(gòu)買或構(gòu)建這樣的系統(tǒng)超出了此原型構(gòu)建的范圍。成像速度的優(yōu)勢(shì)實(shí)際上是雙重的。圖像采集時(shí)間的直接減少是由于在一次曝光中收集了所有光譜信息并消除了濾鏡切換的時(shí)間延遲。激發(fā)光的大安全暴露極限必須僅考慮一次暴露，而不是多次暴露。因此，該技術(shù)的成像速度的第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是安全地增加照明強(qiáng)度，以進(jìn)一步減少足夠的光收集所需的曝光時(shí)間。同時(shí)采集的終優(yōu)勢(shì)是消除了連續(xù)圖像之間的運(yùn)動(dòng)偽像。通過(guò)將ar涂層添加到遠(yuǎn)端和近端mfi光學(xué)器件，可以進(jìn)一步提高光收集效率。?41 ％到10％這三個(gè)主要變化以及其他小的優(yōu)化措施對(duì)于在第二代設(shè)備中實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)mfi成像將是必需的。
一些政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)和其他組織，包括非電離輻射防護(hù)委員會(huì)（icnirp），發(fā)布了眼睛和皮膚的輻射暴露限值。這些是對(duì)內(nèi)部組織的進(jìn)一步研究，它們是的可用指南。375和250 nm的光限制為39,000和7毫焦/ 厘米2，對(duì)于靠近內(nèi)窺鏡的組織，功率密度。假設(shè)組織在篩選過(guò)程中以1 mm的工作距離暴露于紫外線輻射下多1分鐘，則平均激光功率的限制是在375 nm處為5.1 mw，在250 nm處為0.001 mw。豬的組織圖7（d）是在375 nm激發(fā)下以相似的平均激光功率成像的，但工作距離為約10mm 。在更長(zhǎng)的工作距離下，獲取三張連續(xù)圖像的估計(jì)總曝光量為<2％375 nm處的極限值可以通過(guò)實(shí)施上述優(yōu)化進(jìn)一步降低。滿足250 nm激發(fā)下的暴露極限將具有挑戰(zhàn)性，并且需要優(yōu)化系統(tǒng)效率。
此處介紹的設(shè)備實(shí)現(xiàn)了初始的概念驗(yàn)證目標(biāo)。在第二代實(shí)施討論的變更將允許進(jìn)行有限的人體試驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證和完善該技術(shù)。對(duì)于具有第三代設(shè)備的高風(fēng)險(xiǎn)患者，長(zhǎng)期的大型臨床試驗(yàn)對(duì)于確定常規(guī)篩查技術(shù)的實(shí)際療效很有必要。