1.當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)平皿(100mm)后,吸棄舊培養(yǎng)液，10mlpbs洗一遍
2.0.25%胰mei（預(yù)熱20分鐘左右）2ml消化，輕輕搖晃，直至肉眼見單層細(xì)胞呈塊狀脫落（或在顯微鏡下觀察細(xì)胞之間分離），立刻加5ml(dmem+10%fbs)終止消化，輕柔吹打8-10次成單細(xì)胞。
3.離心1000rpm*5min,棄上清，加dmem+10%fbs輕柔吹打。
4.將細(xì)胞懸液1:4傳到100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿加10ml(dmem+10%fbs)培養(yǎng)液，正常情況下2-3天就可以長滿，期間不用換液。
小鼠es-r1細(xì)胞系傳代。
因?yàn)槲覀冇蔑曫B(yǎng)層細(xì)胞鋪皿而不是明膠包被，所以傳代之前必須處理飼養(yǎng)層細(xì)胞。
1.飼養(yǎng)層細(xì)胞sto處理：當(dāng)sto鋪滿平皿后，向培養(yǎng)液中加入100ul 1mg/mlmitomycinc(toxic,操作時(shí)不要接觸，作用是抑制sto增殖)，輕輕搖晃平皿，保證分布均勻，放置于培養(yǎng)箱中處理2h后，吸棄培養(yǎng)液，10mlpbs洗兩遍（目的是把mitomycinc洗凈），0.25%胰mei消化，5ml(dmem+10%fbs)終止，離心1000rpm*5min棄上清，加dmem+10%fbs后吹打均勻，種到新的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)齊培養(yǎng)液至10ml。置于培養(yǎng)箱中過夜。
2.第二天早上傳干細(xì)胞：
（1）吸棄舊培養(yǎng)液，10mlpbs洗一遍，2ml 0.25%胰mei消化，邊消化邊輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，4-5min后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)部分細(xì)胞脫落，成小的細(xì)胞團(tuán)塊，加8ml dmem+10%fbs終止消化，輕柔吹打。
（2）然后將液體轉(zhuǎn)移到15ml塑料離心管中，靜置10-15min，吸棄上清，加2mles培養(yǎng)液。
（3）將滴管在酒精燈下拉成非常細(xì)的玻璃管，吹打1－2次，盡量將es吹散
（4）將前一天鋪好的sto的培養(yǎng)液吸棄，換成10ml的es培養(yǎng)液（操作要小心，不然sto很容易脫落），再把塑料離心管中的es1:3或1:4(視情況而定)傳到鋪好的sto皿中，前后左右垂直晃動(dòng)幾下，使干細(xì)胞分布均勻，置于培養(yǎng)箱中，每天換液，兩到三天傳代。
應(yīng)該注意的問題：
1.sto不管是在es傳代是換液過程中都可能因?yàn)榧右后w速度過快而脫落，所以最hao靠近培養(yǎng)皿壁先一滴一滴加，避免液體直接打在sto上。
2.玻璃管拉得盡量細(xì)一些。
3.一定要把mitomycin洗干凈
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