羧基活化的瓊脂糖可用于固定含胺分子。耦合化學(xué)是基于碳二亞胺的，是一項成功且有據(jù)可查的技術(shù)。
羧基活化瓊脂糖色譜填料(carboxyl-activated sepfast)與含有伯胺基團的配體形成化學(xué)穩(wěn)定的酰胺鍵，它有一個長間隔區(qū)（9個原子）。預(yù)活化的瓊脂糖基質(zhì)可以用于制作各種定制的親和色譜填料，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應(yīng)用。
1.屬性
羧基活化瓊脂糖色譜填料(carboxyl-activated sepfast4hf)由高度交聯(lián)的4%珠狀瓊脂糖制成。它具有高機械剛度，可在降低背壓的情況下實現(xiàn)高流量。
由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結(jié)合特性，長期以來一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結(jié)構(gòu)，對大蛋白質(zhì)分子具有出色的傳質(zhì)性能。
通過將長的親水性間隔臂連接到骨架上來活化基礎(chǔ)基質(zhì)。它直接與分子中的伯胺基反應(yīng)，在碳二亞胺試劑存在下被固定。羧基活化瓊脂糖色譜填料(carboxyl-activated sepfast)以20%乙醇中的水懸浮液形式提供。
表1 羧基活化瓊脂糖色譜填料(carboxyl-activated sepfast4hf)的特性
可耦聯(lián)基團
-nh2
基質(zhì)
高度交聯(lián)的4%瓊脂糖（4hf）
粒徑
50-150 μm
間隔臂
9個原子
活化水平
8-19μmol carboxyl/ml medium
ph穩(wěn)定性
2-13（具有配體依賴性）
化學(xué)穩(wěn)定性
對偶聯(lián)配體能夠接受的所有常用的水性化學(xué)品穩(wěn)定
保存
4℃-8℃
2.配體固定化
以下是配體一般的偶聯(lián)流程。
2.1將目標(biāo)配體溶解在偶聯(lián)緩沖液中，將ph值調(diào)整為4.5。偶聯(lián)緩沖液的體積可以是固定凝膠體積的一半或相同。
2.2在過濾裝置中用至少5倍體積的偶聯(lián)緩沖液清洗羧基活化凝膠。
2.3將洗凈并吸干的凝膠（來自步驟2.2）轉(zhuǎn)移到步驟2.1制備的溶液中。
2.4將碳二亞胺作為干粉或預(yù)先溶解的溶液添加到漿液中，最終濃度為0.1 m。如果碳二亞胺預(yù)先溶解在水中，則將ph值調(diào)整為4.5。
2.5在室溫或4-8℃下混合漿料。
2.6在第1個小時內(nèi)通過添加0.1mnaoh調(diào)節(jié)反應(yīng)ph值至4.5。
2.7 將偶聯(lián)反應(yīng)放置2-24小時。
2.8用5倍體積的0.1 m 醋酸鹽緩沖液+ 0.5m nacl，ph 4.0洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 mtris/hcl+0.5m nacl，ph 8.0洗滌凝膠。重復(fù)上述洗滌2次以上。
2.9使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。
3.固定化效率的一般考慮
3.1 ph
偶聯(lián)反應(yīng)在ph 4.5 - 7.5之間非常有效地進(jìn)行。但是可以優(yōu)化偶聯(lián)ph以獲得最佳結(jié)果（例如，高偶聯(lián)產(chǎn)率和高配體活性）。
在偶聯(lián)反應(yīng)的第1個小時內(nèi)，ph值會降低。要記得通過添加0.1 m naoh來調(diào)節(jié)偶聯(lián)ph值。之后ph值會趨于穩(wěn)定。
3.2 偶聯(lián)方案
去離子水可直接用作偶聯(lián)溶液。應(yīng)避免使用含有氨基、巰基或羧基的緩沖溶液，因為它們會與配體偶聯(lián)發(fā)生競爭。
可以引入稀釋的某些有機溶劑以提高配體的溶解度。應(yīng)事先測試此類溶劑的適用性。
3.3 碳二亞胺的選擇
應(yīng)使用水溶性碳二亞胺，例如1?乙基?3?(3?二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)或1?環(huán)己基?3?(2?嗎啉代乙基)碳二亞胺(cmc)（通常合成為metho?p?甲苯磺酸鹽）。edc是常用的碳二亞胺試劑。
3.4 碳二亞胺的濃度
添加的碳二亞胺的量應(yīng)以化學(xué)計量的方式超過活化的羧基。建議以最終反應(yīng)漿料中的0.1m作為起點。
3.5 反應(yīng)時間和溫度
可以優(yōu)化偶聯(lián)過程中配體和活化填料之間的接觸時間以保持配體的生物活性。
典型的反應(yīng)時間是在室溫或冷藏室中過夜。
3.6 屏蔽剩余的活化配體
如果加入過量的配體，則可能不需要封閉殘留的活化基團。
未與配體反應(yīng)的活化基團應(yīng)在碳二亞胺存在下通過添加額外的含有ph 8 - 9伯胺的小分子（例如1 m乙醇胺）來封端。
3.7 最終填料的洗滌
偶聯(lián)反應(yīng)后需要將未連接或弱連接的配體wan全洗掉。采用高ph值和低ph值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質(zhì)。
4.固定化親和填料的使用
配體偶聯(lián)填料可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質(zhì)相同的原則。
5.儲存
羧基活化瓊脂糖色譜填料(carboxyl-activated sepfast)應(yīng)在8℃下儲存。偶聯(lián)的濕填料應(yīng)在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲存。切勿凍存耦合填料。
6.更多信息
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carboxyl-activated
sepfast 4hf
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380101-1l