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二抗的選擇和定位
*步：選擇抗體。
三種二抗抗體：whole igg，f(aam；rsquo；)2片段，fab片段。
whole igg抗體適用于多數(shù)情況，是的。whole igg是完整的抗體分子，有一個fc部分和兩個與抗原結(jié)合的fab部分 (figure 1, jackson immunoresearch laboratories inc)。
f(aam；rsquo；)2片段抗體是*消化igg除去fc部分，剩下靠二硫鍵連接的結(jié)合抗原的兩個fab部分。f(aam；rsquo；)2片段抗體用在避免抗體與protain a 或g結(jié)合，或者與有fc受體的活細(xì)胞結(jié)合。如果一抗是完整的抗體分子，不管二抗是哪種形式都可能結(jié)合fc受體。
fab片段抗體是用木瓜蛋白酶消化igg后得到的。這些抗體只含有一個fab結(jié)合位點(diǎn)。它們用來封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物種來源的一抗多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中封閉暴露的免疫球蛋白。
第二步：一抗的物種來源。
為了正確的選擇二抗，必須知道一抗的物種來源。如果一抗是小鼠來源的，就找&am；ldquo；anti-mouse&am；rdquo；。
第三步：選擇二抗的物種來源。
第四步：選擇二抗的特異性。
因?yàn)椴煌锓N來源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗一個物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，除非事先特殊處理過(如標(biāo)有&am；ldquo；min x hu, bov&am；hellip；sr prot&am；rdquo； - minimal cro-reactivity to human and bovineerum protei) ), 經(jīng)過用圓括號中的物種 (human, bovine) 的血清蛋白的吸附處理來降低交叉反應(yīng))。在選擇二抗時(shí)，只有在來自兩個很相近的物種的一抗都存在而需要檢測其中一種時(shí)，才使用針對其中一種特殊吸附處理過的抗體。這樣的抗體可能不能和所有亞型的igg都很好的反應(yīng)。比如，在含有內(nèi)源性免疫球蛋白的大鼠的組織樣本中，使用針對大鼠吸附處理過的anti-mouse igg來檢測小鼠的一抗，或者在多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中使用了大鼠的一抗時(shí)。當(dāng)不含有大鼠免疫球蛋白時(shí)，采用沒有針對大鼠igg處理過的anti-mouse二抗來檢測小鼠的一抗。牛血清白蛋白（a）和奶粉中可能含有牛igg。直接針對牛，山羊，馬和綿羊的二抗會跟牛igg反應(yīng)。因此，使用a或者奶粉來封閉或者稀釋這些抗體可能導(dǎo)致背景染色明顯增加，以及抗體效價(jià)的降低。這時(shí)，推薦使用5％的二抗來源物種的正常血清來封閉。
anti-igg (h+l)這類抗體和igg分子的重鏈和輕鏈[比如fc和f(aam；rsquo；)2/fab部分]都可以反應(yīng)。也可以和其他的免疫球蛋白家族（比如igm和iga）反應(yīng)，因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥加邢嗤妮p鏈（&am；kaa；鏈或者&am；lambda；鏈）。anti-igg (h+l) 比只抗片段的抗體識別更多的抗原表位。
anti-igg，fc fragment ecific這類抗體和igg重鏈的fc部分反應(yīng)。它們通過了elisa檢測，和(或)針對fab片段吸附的測試。某些情況下，需要額外檢測和處理來降低和igm或iga的交叉反應(yīng)，會被描述為&am；ldquo；anti-igg, fc&am；gamma；fragment ecific&am；rdquo；。注意：不是所有anti-igg, fc抗體和所有亞型的igg反應(yīng)能力一致。要找和四種igg亞類反應(yīng)能力差不多的anti-mouse igg, fc&am；gamma；抗體的話，應(yīng)當(dāng)選goat anti-mouse igg (subclaes 1+2a+2b+3), fc&am；gamma；fragment ecific (min x hu,bov,rb sr prot)。
anti-igg，fc&am；gamma； subcla ecific抗體分別和不同的小鼠igg亞型重鏈的fc部分反應(yīng)。這類抗體經(jīng)過elisa和/或針對fab片段、igm和其他小鼠igg亞型的吸附測試。
anti-igg，f(aam；rsquo；)2 fragment ecific和igg的f(aam；rsquo；)2/fab部分反應(yīng)。這類抗體經(jīng)過了elisa和/或fc片段的吸附檢測。因?yàn)楹洼p鏈反應(yīng)，它們同時(shí)也和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應(yīng)（如igm和iga）。
(min x&am；hellip；sr prot)這類抗體經(jīng)過了檢測，以及針對igg和圓括號中的物種的血清蛋白的吸附處理。當(dāng)其他物種免疫球蛋白的出現(xiàn)可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)時(shí)，推薦使用這類抗體。但是，當(dāng)要選擇經(jīng)過針對相近物種吸附處理的抗體時(shí)，要特別注意，因?yàn)樗鼈兡茏R別的表位數(shù)量大大減小了，可能識別單抗的能力很弱。這種情況的例子有anti-mouse igg (min x rat,&am；hellip；.sr prot), anti-rat igg (min x mouse, &am；hellip；sr prot), 和 anti-ramenian hamster igg (min x mouse, rat, &am；hellip；sr prot)。
ml （multiple labeling多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)）: 有些抗體標(biāo)明了ml，來強(qiáng)調(diào)它們除了可以用于單標(biāo)，還可用于多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。