操作條件對于色譜分離有很大影響。
１、柱長，柱內(nèi)徑：
一般講，柱管增長，可改善分離能力，短則組分餾出的快些；柱內(nèi)徑小分離效果好，柱內(nèi)徑大處理量大，但柱內(nèi)徑過大，將導(dǎo)致?lián)w不能均勻地分布在色譜柱中。
２、柱溫：
是一個重要的操作變數(shù)，直接影響分離效能和分析速度。選擇柱溫的根據(jù)是混合物的沸點范圍，固定液的配比和鑒定器的靈敏度。提高柱溫可縮短分析時間；
降低柱溫可使色譜柱選擇性增大，有利于組分的分離和色譜柱穩(wěn)定性提高，柱壽命延長。
一般采用等于或高于數(shù)十度于樣品的平均沸點的柱溫為較合適，對易揮發(fā)樣用低柱溫，不易揮發(fā)的樣品采用高柱溫。
３、載氣流速：
載氣流速是決定色譜分離的重要原因之一。一般講流速高色譜峰狹，反之則寬些，但流速過高或過低對分離都有不利的影響。
４、固定相：
固定相是由固體吸附劑或涂有固定液的擔(dān)體構(gòu)成。
當(dāng)用同等長度的柱子，顆粒細(xì)的分離效率就要比粗的好些。
固定液含量對分離效率的影響很大，它與擔(dān)體的重量比一般用１５％－２５％。比例過大有損于分離，比例過小會使色譜峰拖尾。
５、進(jìn)樣：
一般講進(jìn)樣快，進(jìn)樣量小，進(jìn)樣溫度高其分離效果好。對進(jìn)液體樣，速度要快，汽化溫度要高于樣品中高沸點組分的沸點值，一次汽化，保證色譜峰形不致展寬、使柱效高。當(dāng)進(jìn)樣量在一定限度時，色譜峰的半峰寬是不變的。若進(jìn)樣量過多就會造成色譜柱超載。
一般講柱長增加四倍，樣品的許可量增加一倍。