正畸牙齒移動是通過施加機械力來實現(xiàn)的，然后是牙周組織重塑和再生。牙齒將力傳遞到牙周膜，牙周膜將力分布與牙槽骨，牙槽骨發(fā)生組織改建產生牙移動。牙周膜干細胞（pdlscs）是介導正畸力轉導和牙周組織重塑的機械敏感細胞。進一步研究pdlscs對正畸力的反應并更好地了解這種機制對于改善正畸治療方法至關重要。
自噬是一種基本的細胞內過程，介導細胞器降解和再循環(huán)以維持細胞穩(wěn)態(tài)。先前的研究表明，自噬在專門的機械敏感細胞中起到機械適應作用。它在髓核細胞中增加以響應壓縮力刺激，但在足細胞中減少。然而，在正畸壓縮力的作用下，自噬在牙周膜中的作用仍然在很大程度上是未知的。研究初步發(fā)現(xiàn)，在生物力學負荷下，牙周膜成纖維細胞的自噬增加。然而，在牙齒移動過程中，自噬在壓縮區(qū)域受到調節(jié)的確切機制尚不清楚。
長鏈非編碼rnas（lncrnas）是長度大于200個核苷酸的轉錄本，成為自噬領域的關鍵調節(jié)因子。研究表明，lncrnas通過調節(jié)自噬參與各種細胞途徑，包括缺血和再灌注損傷，腫瘤發(fā)生，心血管疾病和糖尿病等。fer-1樣家族成員4（fer1l4）是一種新發(fā)現(xiàn)的 lncrna，已被證明與某些類型的癌癥有關，包括肺癌、肝細胞癌、骨肉瘤和子宮內膜癌。然而，還沒有研究調查fer1l4在自噬中的功能和機制。
因此，北京大學口腔醫(yī)學院正畸科、口腔數(shù)字化醫(yī)療技術和材料國家工程實驗室研究團隊曾探討了pdlscs在壓縮力下的自噬活性，并進一步確定lncrna fer1l4對pdlscs在機械應力下的自噬是否重要，如果重要，潛在的機制是什么。
壓縮力作用下pdlscs中自噬被誘導
將牙周膜干細胞暴露于靜態(tài)壓縮力下（2 g/cm2）12小時（圖1 a）。cck-8測定顯示，有或沒有壓縮力組細胞增殖相似（圖1 b）。流式細胞術分析也證實，與對照組相比，壓縮力組的細胞凋亡和壞死無顯著差異（圖1 c）。進一步測定自噬活性。自噬的兩種生物標志物lc3 ii/i和beclin1的表達水平在壓縮力組中較高（圖1 d）。在熒光顯微鏡下自噬體以多個明亮的綠色熒光斑點存在。壓縮力組lc3呈點狀分布，在核周和細胞質區(qū)域周圍始終顯著（圖1 e）。tem也用于檢測自噬流。自噬體定義為pdlscs細胞質中含有細胞碎片或降解細胞器的雙膜囊泡，在壓縮力組中增加（圖1 f）。為了確定自噬的作用，用自噬抑制劑氯喹（10 μm）處理pdlscs。結果表明，抑制自噬流后凋亡細胞顯著增加（圖1 g）。當用自噬抑制劑預處理細胞時，輕度壓縮力（2 g/cm2）誘導顯著的細胞凋亡（圖1 h）。
圖1 pdlscs在壓縮作用下的自噬增加。將細胞施加靜態(tài)壓縮力12小時。
lncrna fer1l4在受壓縮力作用的pdlscs中顯著上調
先前的rna測序原始數(shù)據(jù)顯示，在壓縮力作用下，pdlscs中的fer1l4顯著增加（約7倍）。為了進一步研究fer1l4的作用，使用fish技術在熒光顯微鏡下觀察fer1l4的分布。結果表明，fer1l4位于細胞核和細胞質中。靜態(tài)壓縮力刺激后，細胞核和細胞質中fer1l4的強度均增加。
fer1l4介導由壓縮力誘導的pdlscs的自噬
為了研究fer1l4在pdlscs自噬調節(jié)中的作用，實驗進行了功能獲得和功能喪失測定。pqll-fer1l4質粒轉染組fer1l4表達顯著升高，sifer1l4轉染組fer1l4表達顯著降低（圖2 a）。
用pqll-fer1l4載體轉染后，蛋白質印跡分析顯示，自噬標志物lc3 ii/i和beclin1的蛋白表達上調（圖2 b）。共聚焦顯微鏡下fer1l4過表達組lc3點狀的細胞質形成顯著增加，表明自噬體形成顯著增加（圖2 c）。tem進一步證實了自噬體和自噬溶酶體的形成。轉染fer1l4載體后，pdlscs細胞質中的自噬體和自噬溶酶體數(shù)量增加（圖2 d）。
為了確定fer1l4是否介導pdlscs在壓縮力下的自噬，用sifer1l4預轉染細胞，然后暴露于機械應力12小時，結果表明，通過敲低fer1l4，機械應力誘導的lc3 ii/i和beclin1表達均被消除（圖2 e）。
圖2 fer1l4促進pdlscs的自噬水平。
fer1l4在施加外部壓縮力期間通過akt/foxo3信號通路調節(jié)自噬
akt信號通路在自噬的負調控中很重要。為了研究fer1l4是否調節(jié)pdlscs中的akt信號通路，實驗進行了蛋白質印跡分析，結果表明，fer1l4過表達抑制了akt（p-akt）的磷酸化，而akt總量幾乎保持不變（圖3 a）。伴隨p-akt的降低，觀察到p-foxo3的顯著降低和foxo3表達的增加（圖3 a）。免疫熒光測定也檢測了foxo3蛋白的定位。fer1l4過表達組foxo3免疫染色較強（圖3 b）。而在fer1l4敲低細胞中，akt的磷酸化和foxo3的磷酸化上調，foxo3的表達下調（圖3 c）。免疫染色也顯示 fer1l4 敲低組 foxo3 的熒光染色相對較弱（圖3 d）。
為了進一步確定fer1l4是否通過akt/foxo3信號通路介導壓縮力下pdlscs的自噬，實驗隨后研究了在施加壓縮力期間該通路的激活情況。基于 kegg 數(shù)據(jù)庫對先前rna測序數(shù)據(jù)的通路分析表明，機械應力顯著影響pi3k/akt信號通路。一致地，暴露于壓縮力的pdlscs中p-akt和p-foxo3顯著降低，而foxo3的核易位增加。然而，當細胞用sifer1l4預轉染時，敲低fer1l4后，壓縮力引起的p-akt和p-foxo3的抑制作用和foxo3的激活作用均消失。
圖3 fer1l4抑制akt的磷酸化，增加foxo3的核易位。
fer1l4和自噬標志物在正畸牙壓縮牙周膜中的表達上調
為了確定fer1l4和自噬在牙周膜對正畸力的反應中的功能，實驗使用了小鼠正畸牙齒移動模型。fish檢測顯示，fer1l4 rna的熒光染色強度在牙周膜的壓縮區(qū)顯著誘導，而對照組牙周膜的熒光強度較低。此外，還確定了正畸牙齒受壓力下牙周膜中的自噬。免疫組織化學染色顯示，在應用正畸加壓的區(qū)域，自噬標志物lc3的活性增加。
圖4 fer1l4通過akt/foxo3通路介導正畸壓縮力作用下牙周膜干細胞自噬的示意圖。
綜上所述，該研究表明，正畸壓縮力誘導牙周膜干細胞自噬，lncrna fer1l4通過akt/foxo3通路介導壓縮力作用下自噬的激活（圖4）。這些發(fā)現(xiàn)表明了lncrna在正畸牙齒移動的牙周組織重塑過程中自噬調控的機制。
參考文獻：huang y, liu h, guo r, han y, yang y, zhao y, zheng y, jia l, li w. long non-coding rna fer1l4 mediates the autophagy of periodontal ligament stem cells under orthodontic compressive force via akt/foxo3 pathway. front cell dev biol. 2021 feb 2;9:631181. doi: 10.3389/fcell.2021.631181. pmid: 33604341; pmcid: pmc7884613.
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