中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
gb 5009.191-2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測(cè)定
前言
本標(biāo)準(zhǔn)代替gb/t5009.191-2006《食品中氯丙醇含量的測(cè)定》、gb/t 18782-2002《調(diào)味品中3-氯-1,2-丙二醇的測(cè)定》、sn/t 0548.1-2002《出口醬油中1,3-二氯-2-丙醇和2,3-二氯-1-丙醇的檢驗(yàn)方法》。
本標(biāo)準(zhǔn)與gb/t 5009.191-2006相比，主要變化如下：
——標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測(cè)定”；
——第二法增加d5-2-mcpd、d5-2,3-dcp作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，將凈化步驟由手填硅藻土層析柱凈化改為硅藻土小柱凈化；
——?jiǎng)h除第三法；
——增加氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食品中氯丙醇脂肪酸酯含量的檢測(cè)方法。
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中氯丙醇和氯丙醇脂肪酸酯的測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中氯丙醇和氯丙醇脂肪酸酯含量的測(cè)定。
本標(biāo)準(zhǔn)包括食品中3-氯-1,2-丙二醇含量的測(cè)定、食品中氯丙醇多組分含量的測(cè)定、食品中氯丙醇脂肪酸酯含量的測(cè)定共3個(gè)檢測(cè)方法。
第一法食品中3-氯-1,2-丙二醇含量的測(cè)定
同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法
2原理
本標(biāo)準(zhǔn)采用同位素稀釋技術(shù)，以d5-3-氯-1,2-丙二醇(d5-3-mcpd)為內(nèi)標(biāo)。試樣中加入內(nèi)標(biāo)，以硅藻土為吸附劑，進(jìn)行固相支持液-液萃取，用正己烷-無(wú)水乙醚溶液(9+1)淋洗去除非極性脂質(zhì)成分，用無(wú)水乙醚洗脫3-氯-1,2-丙二醇(3-mcpd)。以七氟丁?；溥蜓苌?，采用氣相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。
3試劑和材料
除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水。
3.1試劑
3.1.1乙酸乙酯(c4h8o2)：色譜純。
3.1.2正己烷(c6h14)：色譜純。
3.1.3無(wú)水乙醚(c4h10o)：使用前需重蒸，重蒸時(shí)加少量還原鐵粉。
3.1.4氯化鈉(nacl)。
3.1.5無(wú)水硫酸鈉(na2so4)：使用前于120℃烘烤4h。
3.1.6七氟丁?；溥?c7h3f7n2o，cas號(hào)32477-35-3)：純度≥98%。
3.2試劑配制
3.2.1氯化鈉溶液(20%)：稱取氯化鈉20g，加入80ml水，攪拌使氯化鈉充分溶解。
3.2.2正己烷-無(wú)水乙醚溶液(9+1)：將450ml正己烷與50ml無(wú)水乙醚混合均勻。
3.3標(biāo)準(zhǔn)品
3.3.1 3-氯-1,2-丙二醇(3-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3h7clo2，cas號(hào)96-24-2)：純度≥98%。
3.3.2 d5-3-氯-1,2-丙二醇(d5-3-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3d5h2clo2)：純度≥98%。
3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
注：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制好后均需轉(zhuǎn)移至密閉性非常好的棕色玻璃容器中，于-20℃貯存。
3.4.1 3-mcpd和d5-3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l)：分別準(zhǔn)確稱取3-mcpd和d5-3-mcpd各10mg(精確至0.01mg)，用乙酸乙酯溶解，分別轉(zhuǎn)移至2個(gè)10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，混勻。保存期為2年。
3.4.2 3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)：準(zhǔn)確移取3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l)0.1ml于10ml
容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，混勻。保存期為1年。
3.4.3 3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)工作液(1mg/l)：準(zhǔn)確移取3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)1ml于10ml容量
瓶中，用正己烷稀釋至刻度，混勻。保存期為6個(gè)月。
3.4.4 d5-3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)：準(zhǔn)確移取d5-3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l)0.25ml
于25ml容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，混勻。保存期為1年。
3.4.5 3-mcpd系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)工作液(1mg/l)0.01ml、0.05ml、0.1ml、
0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.6ml和3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)0.32ml于密閉性很好的適當(dāng)體
積(5ml或10ml)的透明具塞(蓋)玻璃管中，分別加入d5-3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)20μl，加正己烷至2ml，配制成含3-mcpd質(zhì)量分別為10ng、50ng、100ng、200ng、400ng、800ng、1600ng、3200ng的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中d5-3-mcpd的質(zhì)量均為200ng。臨用現(xiàn)配。
3.5材料
3.5.1硅藻土。
3.5.2氣密針：1ml。
3.5.3玻璃層析柱：柱長(zhǎng)40cm，柱內(nèi)徑2cm。
4儀器和設(shè)備
4.1氣相色譜-質(zhì)譜儀。
4.2電子天平：感量分別為1mg和0.01mg。
4.3超聲振蕩器。
4.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
4.5恒溫箱或其他恒溫加熱器。
4.6渦旋振蕩器。
4.7離心機(jī)。
5分析步驟
5.1試樣制備
液態(tài)樣品搖勻；基質(zhì)均勻的半固態(tài)樣品和粉狀固態(tài)樣品直接測(cè)定；其他樣品需勻漿粉碎均勻。制備好的試樣于0℃~5℃保存。
5.2試樣提取
5.2.1液態(tài)試樣
稱取試樣4g(精確至0.001g)于50ml燒杯中，加入d5-3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)20μl，加入氯化鈉溶液(20%)4g，超聲混勻5min，待凈化。
5.2.2半固態(tài)及固態(tài)試樣(提取后無(wú)明顯殘?jiān)陌牍虘B(tài)及固態(tài)試樣)
稱取試樣4g(精確至0.001g)于50ml燒杯中，加入d5-3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)20μl，加入氯化鈉溶液(20%)6g，超聲10min，待凈化。
5.2.3半固態(tài)及固態(tài)試樣(提取后有明顯殘?jiān)陌牍虘B(tài)及固態(tài)試樣)
稱取試樣4g(精確至0.001g)于15ml離心管中，加入d5-3-mcpd標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)20μl，加入氯化鈉溶液(20%)15g，超聲提取10min，以5000r/min離心10min，移取上清液，待凈化。
5.3試樣凈化
取硅藻土5g，加入提取液，充分混勻，放置10min。
取5g硅藻土裝入層析柱中(層析柱下端填充少量玻璃棉)（氯丙醇專用柱“注：括號(hào)內(nèi)容非國(guó)標(biāo)內(nèi)容，此項(xiàng)為商品化的硅藻土小柱，僅供參考”）。將提取液與硅藻土的混合物裝入層析柱中，上層加1cm高度的無(wú)水硫酸鈉。用40ml正己烷-無(wú)水乙醚溶液(9+1)淋洗，棄去流出液。用150ml無(wú)水乙醚洗脫3-mcpd(流速約為8ml/min)，收集流出液，加入15g無(wú)水硫酸鈉，混勻以吸收水分，放置10min后以漏斗過(guò)濾。濾液于35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干(約0.5ml)，用2ml正己烷溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至密閉性很好的適當(dāng)體積(5ml或10ml)的透明具塞(蓋)玻璃管中，待衍生化。
5.4衍生化
用氣密針向正己烷復(fù)溶液中加入0.04ml七氟丁?；溥?，立即密塞，渦旋混合30s，于70℃保溫20min。取出放至室溫，加入2ml氯化鈉溶液(20%)，渦旋1min，靜置，使水相和正己烷相分層，且水相澄清。移出正己烷相，加入約0.3g無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥，將溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。
同時(shí)做3-mcpd系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生化。
5.5空白試樣溶液制備
稱取與試樣相同質(zhì)量的氯化鈉溶液(20%)或空白試樣，以下步驟按5.2、5.3和5.4與試樣同時(shí)處理，以考察在試樣測(cè)定過(guò)程中是否存在系統(tǒng)污染。
5.6儀器參考條件
5.6.1氣相色譜參考條件
5.6.1.1色譜柱：含5%苯基亞芳基聚合物或5%苯基-甲基聚硅氧烷的弱極性毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜柱(柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.25μm，膜厚0.25μm)，或性能相當(dāng)者。
5.6.1.2載氣：氦氣，流速為1ml/min。
5.6.1.3進(jìn)樣口溫度：250℃。
5.6.1.4進(jìn)樣體積：1μl，不分流進(jìn)樣，不分流時(shí)間為0.5min，溶劑延遲時(shí)間為5min。。
5.6.1.5程序升溫：50℃保持1min，以2℃/min升至90℃，再以40℃/min升至270℃，并保持5min。
5.6.2質(zhì)譜參考條件
5.6.2.1離子源：電子轟擊源(ei)。
5.6.2.2電離能量：70ev。
5.6.2.3離子源溫度：250℃。
5.6.2.4傳輸線溫度：280℃。
5.6.2.5掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)模式(sim)。
5.6.2.6監(jiān)測(cè)離子：3-mcpd衍生物定量離子m/z 253，定性離子m/z 275、m/z 289、m/z 291；d5-3-mcpd衍生物定量離子m/z257，定性離子m/z278、m/z294、m/z296。
5.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將1μl3-mcpd系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生液按濃度由低到高依次注入氣相色譜-質(zhì)譜儀中，測(cè)得3-mcpd和d5-3-mcpd的衍生物的峰面積，以3-mcpd系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的3-mcpd和d5-3-mcpd的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，以3-mcpd和d5-3-mcpd的衍生物的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.8試樣溶液的測(cè)定
將1μl試樣溶液注入氣相色譜-質(zhì)譜儀中，測(cè)得峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中3-mcpd的質(zhì)量。
6分析結(jié)果的表述
試樣中3-mcpd的含量按式(1)計(jì)算：
式中：
x——試樣中3-mcpd的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；
a——試樣溶液中3-mcpd的質(zhì)量，單位為納克(ng)；
f——稱取試樣后進(jìn)行分析測(cè)定前的稀釋倍數(shù)；
m——試樣的質(zhì)量，單位為克(g)；
1000——換算系數(shù)。
計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
7精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。
8其他
食品中3-氯-1,2-丙二醇的檢出限為0.005mg/kg，定量限為0.01mg/kg。
第二法食品中氯丙醇多組分含量的測(cè)定
同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法
9原理
本標(biāo)準(zhǔn)采用同位素稀釋技術(shù)，以d5-3-氯-1,2-丙二醇(d5-3-mcpd)、d5-2-氯-1,3-丙二醇(d5-2-
mcpd)、d5-1,3-二氯-2-丙醇(d5-1,3-dcp)和d5-2,3-二氯-2-丙醇(d5-2,3-dcp)為內(nèi)標(biāo)。試樣中加入內(nèi)標(biāo)，以氯化鈉溶液提取，采用硅藻土小柱進(jìn)行凈化，用正己烷淋洗，用乙酸乙酯洗脫氯丙醇，經(jīng)七氟丁?；溥蜓苌?，以氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。
10試劑和材料
除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水。
10.1試劑
10.1.1乙酸乙酯(c4h8o2)：色譜純。
10.1.2正己烷(c6h14)：色譜純。
10.1.3氯化鈉(nacl)。
10.1.4無(wú)水硫酸鈉(na2so4)：使用前于120℃烘烤4h。
10.1.5七氟丁酰基咪唑(c7h3f7n2o，cas號(hào)32477-35-3)：純度≥98%。
10.2試劑配制
氯化鈉溶液(20%)：稱取氯化鈉20g，加入80ml水，攪拌使氯化鈉充分溶解。
10.3標(biāo)準(zhǔn)品
10.3.1 3-氯-1,2-丙二醇(3-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3h7clo2，cas號(hào)96-24-2)：純度≥98%。
10.3.2 d5-3-氯-1,2-丙二醇(d5-3-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3d5h2clo2)：純度≥98%。
10.3.3 2-氯-1,3-丙二醇(2-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3h7clo2，cas號(hào)497-04-1)：純度≥98%。
10.3.4 d5-2-氯-1,3-丙二醇(d5-2-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3d5h2clo2)：純度≥98%。
10.3.5 1,3-二氯-2-丙醇(1,3-dcp)標(biāo)準(zhǔn)品(c3h6cl2o，cas號(hào)96-23-1)：純度≥98%。
10.3.6 d5-1,3-二氯-2-丙醇(d5-1,3-dcp)標(biāo)準(zhǔn)品(c3d5hcl2o)：純度≥98%。
10.3.7 2,3-二氯-1-丙醇(2,3-dcp)標(biāo)準(zhǔn)品(c3h6cl2o，cas號(hào)616-23-9)：純度≥98%。
10.3.8 d5-2,3-二氯-1-丙醇(d5-2,3-dcp)標(biāo)準(zhǔn)品(c3d5hcl2o)：純度≥97%。
10.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
注：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制好后均需轉(zhuǎn)移至密閉性非常好的棕色玻璃容器中，于-20℃貯存。
10.4.1氯丙醇及氘代氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l)：分別準(zhǔn)確稱取3-mcpd、2-mcpd、1,3-dcp、
2,3-dcp、d5-3-mcpd、d5-2-mcpd、d5-1,3-dcp和d5-2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)品各10mg(精確至0.01mg)分別用乙酸乙酯溶解，分別轉(zhuǎn)移至8個(gè)10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，混勻。保存期為2年。
10.4.2氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)：分別移取3-mcpd、2-mcpd、1,3-dcp和2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1000mg/l)0.1ml于4個(gè)10ml容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻。保存期為1年。
10.4.3氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1mg/l)：準(zhǔn)確移取3-mcpd、2-mcpd、1,3-dcp和2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)各1ml于10ml容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，混勻。保存期為6個(gè)月。
10.4.4氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)：分別移取d5-3-mcpd、d5-2-mcpd、d5-1,3-dcp和d5-2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l)各0.1ml于10ml容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，混勻。保存期為1年。
10.4.5氯丙醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 mg/l)0.01 ml、0.05 ml、
0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.6ml和氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)各0.32ml于密閉性很好的適當(dāng)體積(5ml或10ml)的透明具塞(蓋)玻璃管中，分別加入氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)20μl，加正己烷至2ml，混勻，配制成含各氯丙醇質(zhì)量分別為10ng、50ng、100ng、200ng、400ng、800ng、1600ng、3200ng的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中各氘代氯丙醇的質(zhì)量均為200ng。臨用現(xiàn)配。
10.5材料
10.5.1硅藻土小柱：規(guī)格為5g。
10.5.2氣密針：1ml。
11儀器和設(shè)備
11.1氣相色譜-質(zhì)譜儀。
11.2電子天平：感量分別為1mg和0.01mg。
11.3超聲波振蕩器。
11.4氮?dú)鉂饪s器。
11.5恒溫箱或其他恒溫加熱器。
11.6渦旋振蕩器。
11.7離心機(jī)。
12分析步驟
12.1試樣制備
液態(tài)樣品搖勻；基質(zhì)均勻的半固態(tài)樣品和粉狀固態(tài)樣品直接測(cè)定；其他樣品需勻漿粉碎均勻。制備好的試樣于0℃~5℃保存。
12.2試樣提取
12.2.1液態(tài)試樣
稱取試樣4g(精確至0.001g)于15ml玻璃離心管中，加入氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)20μl，超聲混勻5min，待凈化。
12.2.2半固態(tài)及固態(tài)試樣
稱取試樣4g(精確至0.001g)于15ml玻璃離心管中，加入氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)20μl，加入4g氯化鈉溶液(20%)，超聲提取10min，以5000r/min離心10min，移取上清液，再重復(fù)提取1次，合并上清液，待凈化。
12.3試樣凈化
將上清液全部轉(zhuǎn)移至硅藻土小柱中，平衡10min。以10ml正己烷淋洗，棄去流出液，以15ml乙酸乙酯洗脫氯丙醇，收集洗脫液于玻璃離心管中，以氮?dú)鉂饪s至近干(約0.5ml，切忌濃縮至全干)，以2ml正己烷溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移至密閉性很好的適當(dāng)體積(5ml或10ml)的透明具塞(蓋)玻璃管中，待衍生化。
12.4衍生化
用氣密針向凈化液中加入0.04 ml七氟丁?；溥?，立即密塞，渦旋混合30s，于70℃保溫20min。取出冷卻至室溫，加入2ml氯化鈉溶液(20%)，渦旋混合1min，使水相和正己烷相分層，且水相澄清。轉(zhuǎn)移正己烷相，加入約0.3g無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥，轉(zhuǎn)移溶液至進(jìn)樣小瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。
同時(shí)做氯丙醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生化。
12.5空白試樣溶液制備
稱取與試樣相同質(zhì)量的氯化鈉溶液(20%)或空白試樣，以下步驟按12.2、12.3和12.4與試樣同時(shí)處理，以考察在試樣測(cè)定過(guò)程中是否存在系統(tǒng)污染。
12.6儀器參考條件
12.6.1氣相色譜參考條件
12.6.1.1色譜柱：含5%苯基亞芳基聚合物或5%苯基-甲基聚硅氧烷的弱極性毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜柱(柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.25μm，膜厚0.25μm)，或性能相當(dāng)者。
12.6.1.2載氣：氦氣，流速為1ml/min。
12.6.1.3進(jìn)樣口溫度：250℃。
12.6.1.4進(jìn)樣量：1μl，不分流進(jìn)樣，不分流時(shí)間為0.5min，溶劑延遲時(shí)間為5min。
12.6.1.5程序升溫：50℃保持1min，以2℃/min升至90℃，再以40℃/min升至270℃，并保持5min。
12.6.2質(zhì)譜參考條件
12.6.2.1電離源：電子轟擊源。
12.6.2.2電離能量：70ev。
12.6.2.3離子源溫度：250℃。
12.6.2.4傳輸線溫度：280℃。
12.6.2.5掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)模式(sim)。
12.6.2.6監(jiān)測(cè)離子：見(jiàn)表1。
12.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將1μl氯丙醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生液按濃度由低到高依次注入氣相色譜-質(zhì)譜儀中，測(cè)得氯丙醇和氘代氯丙醇的衍生物的峰面積，以各氯丙醇和其對(duì)應(yīng)的氘代氯丙醇的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，以各氯丙醇和其對(duì)應(yīng)的氘代氯丙醇的衍生物的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
12.8試樣溶液的測(cè)定
將1μl試樣溶液注入氣相色譜-質(zhì)譜儀中，測(cè)得氯丙醇和氘代氯丙醇的衍生物的峰面積。
13分析結(jié)果的表述
試樣中氯丙醇的含量按式(2)計(jì)算：
式中：
x——試樣中各氯丙醇的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；
a——試樣溶液中各氯丙醇的質(zhì)量，單位為納克(ng)；
f——稱取試樣后進(jìn)行分析測(cè)定前的稀釋倍數(shù)；
m——試樣的質(zhì)量，單位為克(g)；
1000——換算系數(shù)。
計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
14精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。
15其他
食品中3-mcpd、2-mcpd、1,3-dcp和2,3-dcp的檢出限分別為0.002 mg/kg、0.002 mg/kg、
0.005mg/kg、0.005mg/kg，定量限分別為0.005mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.01mg/kg。
第三法食品中氯丙醇脂肪酸酯含量的測(cè)定
氣相色譜-質(zhì)譜法
16原理
試樣中加入氘代氯丙醇脂肪酸酯，以正己烷提取，以甲醇鈉-甲醇溶液進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng)，使氯丙醇脂肪酸酯轉(zhuǎn)化為氯丙醇和相應(yīng)的脂肪酸甲酯，以冰乙酸終止反應(yīng)，加入溴化鈉溶液，并用正己烷進(jìn)行液-液萃取，以去除生成的脂肪酸甲酯和其他非極性雜質(zhì)，然后用硅藻土小柱凈化，以乙酸乙酯洗脫氯丙醇，經(jīng)七氟丁酰基咪唑衍生，以氣相色譜-質(zhì)譜儀檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。
17試劑和材料
除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水。
17.1試劑
17.1.1甲醇(ch4o)。
17.1.2甲基叔丁基醚(c5h12o)。
17.1.3甲醇鈉(ch3ona)。
17.1.4冰乙酸(ch3cooh)：優(yōu)級(jí)純。
17.1.5乙酸乙酯(c4h8o2)：色譜純。
17.1.6正己烷(c6h14)：色譜純。
17.1.7乙腈(ch3cn)：色譜純。
17.1.8無(wú)水硫酸鈉(na2so4)：使用前于120℃烘烤4h。
17.1.9溴化鈉(nabr)。
17.1.10七氟丁?；溥?c7h3f7n2o，cas號(hào)32477-35-3)：純度≥98%。
17.2試劑配制
17.2.1氯化鈉溶液(20%)：稱取氯化鈉20g，加入80ml水，攪拌使氯化鈉充分溶解。
17.2.2溴化鈉溶液(20%)：稱取溴化鈉20g，加入80ml水，攪拌使溴化鈉充分溶解。
17.2.3甲基叔丁基醚-乙酸乙酯溶液(8+2)：量取40ml甲基叔丁基醚，加入10ml乙酸乙酯，混勻。
17.2.4甲醇鈉-甲醇溶液(0.5mol/l)：稱取2.7g甲醇鈉，加入50ml甲醇，攪拌并充分混勻。
17.3標(biāo)準(zhǔn)品
17.3.1 3-氯-1,2-丙二醇(3-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3h7clo2，cas號(hào)96-24-2)：純度≥98%。
17.3.2 d5-3-氯-1,2-丙二醇(d5-3-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3d5h2clo2)：純度≥98%。
17.3.3 2-氯-1,3-丙二醇(2-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3h7clo2，cas號(hào)497-04-1)：，純度≥98%。
17.3.4 d5-2-氯-1,3-丙二醇(d5-2-mcpd)標(biāo)準(zhǔn)品(c3d5h2clo2)：純度≥98%。
17.3.5 1,3-二氯-2-丙醇標(biāo)準(zhǔn)品(1,3-dcp)(c3h6cl2o，cas號(hào)96-23-1)：純度≥98%。
17.3.6 d5-1,3-二氯-2-丙醇(d5-1,3-dcp)標(biāo)準(zhǔn)品(c3d5hcl2o)：純度≥98%。
17.3.7 2,3-二氯-1-丙醇(2,3-dcp)標(biāo)準(zhǔn)品(c3h6cl2o，cas號(hào)616-23-9)：純度≥98%。
17.3.8 d5-2,3-二氯-1-丙醇(d5-2,3-dcp)標(biāo)準(zhǔn)品(c3d5hcl2o)：純度≥97%。
17.3.9 3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯(3-mcpd棕櫚酸雙酯)標(biāo)準(zhǔn)品(c35h67clo4，cas號(hào)51930-97-3)：純度≥98%。
17.3.10 d5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸單酯(d5-3-mcpd棕櫚酸單酯)標(biāo)準(zhǔn)品(c19d5h32clo3)：純度≥98%。
17.3.11 2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯(2-mcpd硬脂酸雙酯)標(biāo)準(zhǔn)品(c39h75clo4，cas號(hào)26787-56-4)：純度≥95%。
17.3.12 d5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯(d5-2-mcpd硬脂酸雙酯)標(biāo)準(zhǔn)品(c39d5h70clo4)：純度≥98%。
注：17.3.10中，亦可采用d5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為內(nèi)標(biāo)。
17.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
注：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制好后均需轉(zhuǎn)移至密閉性非常好的棕色玻璃容器中，于-20℃貯存。
17.4.1氯丙醇和氘代氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l)：分別準(zhǔn)確稱取3-mcpd、2-mcpd、1,3-dcp和2,3-dcp、d5-3-mcpd、d5-2-mcpd、d5-1,3-dcp和d5-2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)品各10mg(精確至0.01mg)，分別用乙酸乙酯溶解，轉(zhuǎn)移至8個(gè)10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，混勻。保存期為2年。
17.4.2氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)：分別移取3-mcpd、2-mcpd、1,3-dcp和2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l)0.1ml于4個(gè)10ml容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻。保存期為1年。
17.4.3氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1mg/l)：移取3-mcpd、2-mcpd、1,3-dcp和2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)各1ml于10ml容量瓶中，用正己烷定容至刻度，混勻。保存期為6個(gè)月。
17.4.4氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)：移取d5-3-mcpd、d5-2-mcpd、d5-1,3-dcp和d5-2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l)各0.1ml于10ml容量瓶中，用正己烷定容至刻度，混勻。保存期為1年。
17.4.5氯丙醇脂肪酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l，以對(duì)應(yīng)的氯丙醇計(jì))：分別準(zhǔn)確稱取3-mcpd棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品53.1mg(精確至0.01mg)、2-mcpd硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品58.1mg(精確至0.01mg)，分別用乙酸乙酯溶解，轉(zhuǎn)移至2個(gè)10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，混勻。保存期為2年。
17.4.6氯丙醇脂肪酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(10mg/l，以對(duì)應(yīng)的氯丙醇計(jì))：分別移取3-mcpd棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l，以3-mcpd計(jì))和2-mcpd硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l，以2-mcpd計(jì))各0.1ml于10ml容量瓶中，用正己烷定容至刻度，混勻。保存期為1年。
17.4.7氘代氯丙醇脂肪酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l，以對(duì)應(yīng)的氘代氯丙醇計(jì))：分別準(zhǔn)確稱取d5-3-mcpd棕櫚酸單酯標(biāo)準(zhǔn)品30.6mg(精確至0.01mg)、d5-2-mcpd硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品56.0mg(精確至0.01mg)，分別用乙酸乙酯溶解，轉(zhuǎn)移至2個(gè)10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，混勻。保存期為2年。
17.4.8氘代氯丙醇脂肪酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(10mg/l，以對(duì)應(yīng)的氘代氯丙醇計(jì))：移取d5-3-mcpd棕櫚酸單酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000 mg/l，以d5-3-mcpd計(jì))和d5-2-mcpd硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/l，以d5-2-mcpd計(jì))各0.1ml于10ml容量瓶中，用正己烷定容至刻度，混勻。保存期為1年。
17.4.9氯丙醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：分別移取氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1 mg/l)0.01 ml、
0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.6ml和氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)各0.32ml于密閉性很好的適當(dāng)體積(5ml或10ml)的透明具塞(蓋)玻璃管中，分別加入氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)20μl，加正己烷至2ml，混勻，配制成含各氯丙醇質(zhì)量分別為10ng、50ng、100ng、200ng、400ng、800ng、1600ng、3200ng的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中各氘代氯丙醇的質(zhì)量均為200ng。臨用現(xiàn)配。
17.5材料
17.5.1硅藻土小柱：規(guī)格為5g。
17.5.2氣密針：1ml。
18儀器和設(shè)備
18.1氣相色譜-質(zhì)譜儀。
18.2電子天平：感量分別為1mg和0.01mg。
18.3超聲波振蕩器。
18.4氮?dú)鉂饪s器。
18.5恒溫箱或其他恒溫加熱器。
18.6渦旋振蕩器。
18.7離心機(jī)。
19分析步驟
19.1試樣制備
液態(tài)樣品搖勻；基質(zhì)均勻的半固態(tài)樣品和粉狀固態(tài)樣品直接測(cè)定；其他樣品需勻漿粉碎均勻。制備好的試樣于0℃~5℃保存。
19.2試樣提取
19.2.1植物油、動(dòng)物油等油脂類試樣
稱取試樣0.1g~0.2g(精確至0.001g)，加入氘代氯丙醇脂肪酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l，以對(duì)應(yīng)的氘代氯丙醇計(jì))20μl、d5-1,3-dcp和d5-2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)各20μl。
19.2.2其他試樣
稱取試樣2g(精確至0.001g)，加入氘代氯丙醇脂肪酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l，以對(duì)應(yīng)的氘代氯丙醇計(jì))20μl。加入4ml正己烷，充分振搖混勻，超聲提取20min，靜置分層后，轉(zhuǎn)移出上層正己烷相。再重復(fù)提取2次，合并正己烷相，加入d5-1,3-dcp和d5-2,3-dcp標(biāo)準(zhǔn)工作液(10mg/l)各20μl，以氮?dú)鉂饪s至約1ml。
注：對(duì)于乳粉、咖啡等固體粉末試樣，需先加2ml水溶解后再用正己烷提取。對(duì)于香腸等動(dòng)物性食品試樣，可采用經(jīng)乙腈飽和的正己烷作為提取液。
19.3酯鍵斷裂反應(yīng)
向試樣提取液中加入0.5 ml甲基叔丁基醚-乙酸乙酯溶液(8+2)和1 ml甲醇鈉-甲醇溶液
(0.5mol/l)，蓋緊蓋子，渦旋振蕩30s。室溫反應(yīng)4min，加入100μl冰乙酸終止反應(yīng)。加入3ml溴化鈉溶液(20%)和3ml正己烷，渦旋振蕩30s，靜置1min，棄去上層正己烷相，再用3ml正己烷萃取一次，棄去上層正己烷相，下層的水相溶液待凈化。
注：此步驟中如采用氯化鈉溶液(20%)萃取，則經(jīng)后續(xù)步驟測(cè)定得到的是氯丙醇脂肪酸酯和縮水甘油酯的總含量。
19.4試樣凈化
將水相溶液倒入硅藻土小柱中，平衡10min后，用15ml乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，在洗脫液中加入4g無(wú)水硫酸鈉，放置10min后過(guò)濾，轉(zhuǎn)移濾液至密閉性很好的適當(dāng)體積(5ml或10ml)的透明具塞(蓋)玻璃管中，以氮?dú)鉂饪s至近干(約0.5ml，切忌濃縮至全干)，用2ml正己烷溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，待進(jìn)行衍生化反應(yīng)。
19.5衍生化
用氣密針向凈化液中加入0.04ml七氟丁?；溥?，立即密塞。渦旋混合后，于70℃保溫20min。取出放至室溫，加2ml氯化鈉溶液(20%)，渦旋1min，使兩相分層，且水相澄清。取出上層有機(jī)相，加0.3g無(wú)水硫酸鈉吸水干燥，將溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。
同時(shí)做系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生化反應(yīng)。
19.6空白試樣溶液制備
稱取與試樣相同質(zhì)量的溴化鈉溶液(20%)或空白試樣，以下步驟按19.2、19.3、19.4和19.5與試樣同時(shí)處理，以考察在試樣測(cè)定過(guò)程中是否存在系統(tǒng)污染。
19.7儀器參考條件
19.7.1氣相色譜參考條件
19.7.1.1色譜柱：含5%苯基亞芳基聚合物或5%苯基-甲基聚硅氧烷的弱極性毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜柱(柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.25μm，膜厚0.25μm)，或性能相當(dāng)者。
19.7.1.2載氣：氦氣，流速為1ml/min。
19.7.1.3進(jìn)樣口溫度：250℃。
19.7.1.4進(jìn)樣量：1μl，不分流進(jìn)樣，不分流時(shí)間為0.5min，溶劑延遲時(shí)間為5min。
19.7.1.5程序升溫：50℃保持1min，以2℃/min升至90℃，再以40℃/min升至270℃，并保持5min。
19.7.2質(zhì)譜參考條件
19.7.2.1電離源：電子轟擊源。
19.7.2.2電離能量：70ev。
19.7.2.3離子源溫度：250℃。
19.7.2.4傳輸線溫度：280℃。
19.7.2.5掃描方式：選擇離子監(jiān)測(cè)模式(sim)。
19.7.2.6監(jiān)測(cè)離子：見(jiàn)表1。
19.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將1μl系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生液按濃度由低到高依次注入氣相色譜-質(zhì)譜儀，測(cè)得各氯丙醇和氘代氯丙醇的衍生物的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液中氯丙醇與其對(duì)應(yīng)的氘代氯丙醇的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，以氯丙醇與其對(duì)應(yīng)的氘代氯丙醇的衍生物的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
19.9試樣溶液的測(cè)定
將1μl試樣溶液注入氣相色譜-質(zhì)譜儀，測(cè)得相應(yīng)的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中各氯丙醇的質(zhì)量。
20分析結(jié)果的表述
試樣中各氯丙醇脂肪酸酯(3-mcpd酯、2-mcpd酯、1,3-dcp酯和2,3-dcp酯)的含量按式(3)計(jì)算：
式中：
x——試樣中3-mcpd酯、2-mcpd酯、1,3-dcp酯和2,3-dcp酯的含量，分別以3-mcpd、2-mcpd、1,3-dcp和2,3-dcp計(jì)，單位為毫克每千克(mg/kg)；
a——試樣溶液中3-mcpd、2-mcpd、1,3-dcp和2,3-dcp的質(zhì)量，單位為納克(ng)；
f——稱取試樣后進(jìn)行分析測(cè)定前的稀釋倍數(shù)；
m——試樣的質(zhì)量，單位為克(g)；
1000——換算系數(shù)。
計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
21精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。
22其他
食用油等油脂類樣品中3-mcpd酯、2-mcpd酯、1,3-dcp酯和2,3-dcp酯的檢出限均為
0.01mg/kg，定量限均為0.025mg/kg；其他食品中3-mcpd酯、2-mcpd酯、1,3-dcp酯和2,3-dcp酯的檢出限分別為0.005mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.01mg/kg，定量限分別為0.01mg/kg、0.01mg/kg、0.025mg/kg、0.025mg/kg。