電轉(zhuǎn)百科指南①：如何提高電轉(zhuǎn)染效率？技術(shù)專家總結(jié)以下八點(diǎn)！
電轉(zhuǎn)百科指南②：不同細(xì)胞的電轉(zhuǎn)技巧，收藏了慢慢看！
電轉(zhuǎn)百科指南③：手把手教程來了，20種常用細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案
電轉(zhuǎn)百科指南④：每日問候你的細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果好嗎，支原體污染要避免
本周第五期電轉(zhuǎn)百科我們將更進(jìn)一步，為大家?guī)韈rispr基因編輯的內(nèi)容，本章內(nèi)容將分為knock-out與knock-in上下篇，請繼續(xù)關(guān)注下一期的后續(xù)！
01/上篇
knock-out
lonza nucleofector™核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可以廣泛應(yīng)用于多種不同的場景，在不同的應(yīng)用場景下通常會(huì)使用dna或rna或蛋白進(jìn)行外源基因的遞送，以實(shí)現(xiàn)特殊的應(yīng)用需求。
以crispr系統(tǒng)為例，全球有大量的客戶使用lonza nucleofector™核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)開展基于crispr系統(tǒng)的基因編輯相關(guān)工作并發(fā)表文章且逐年遞增。
▲google scholar search for ‘nucleofector crispr’, july 2023
·對于crispr的轉(zhuǎn)染，即可以通過表達(dá)cas9的質(zhì)粒系統(tǒng)如px458載體來實(shí)現(xiàn)“剪刀” cas9的遞送，也可以通過cas9 mrna的方式在細(xì)胞質(zhì)中直接翻譯，與sgrna形成復(fù)合物后再進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行基因組編輯。當(dāng)然我們也可以在轉(zhuǎn)染前提前將cas9蛋白與sgrna進(jìn)行孵育形成rnp復(fù)合物，再通過電轉(zhuǎn)染遞送到細(xì)胞內(nèi)，直接進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行基因組編輯。
·對于crispr應(yīng)用，主要用于knock-out或knock-in
knock out：盡管knock-out已經(jīng)比較容易實(shí)現(xiàn)高效的敲除效率，但對于陌生的細(xì)胞或者全新的位點(diǎn)依然需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。包括但不限于以下方面：
不同的nucleofection條件測試
lonza為多種常用的細(xì)胞提供預(yù)優(yōu)化的電轉(zhuǎn)程序，電轉(zhuǎn)程序與細(xì)胞相關(guān)，通常來說，即使電轉(zhuǎn)不同的核酸底物(dna，rna，蛋白等)無需對電轉(zhuǎn)程序進(jìn)行調(diào)整，但在越來越多的原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染中，使用rna或rnp進(jìn)行細(xì)胞基因編輯時(shí)，可以通過對程序進(jìn)行適當(dāng)?shù)奈⒄{(diào)，以獲得更高編輯效率的同時(shí)，更好的維持細(xì)胞的活率及功能。對于常見的t cell，hspc，nk，dc等免疫細(xì)胞可以對nucleofection脈沖條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
▲akiko seki et al., 2018
不同的crrna/sgrna測試
對于同一基因不同的sgrna表現(xiàn)可能不同，目前已有大量設(shè)計(jì)sgrna序列的工具，部分工具也可以為其打分，但通常還是建議盡可能測試多個(gè)sgrna以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果。甚至結(jié)合多條sgrna對同一基因進(jìn)行編輯。
▲akiko seki et al., 2018
不同cas9蛋白的測試
對于不同供應(yīng)商的cas9蛋白也存在切割活性的差異，對于wt cas9和一些經(jīng)過優(yōu)化的cas9蛋白也會(huì)導(dǎo)致編輯效率的差異。
▲akiko seki et al., 2018
▲liyang zhang et al., 2021
cas9用量測試
除對不同cas9蛋白來源的測試外，cas9的用量也是需要在試驗(yàn)優(yōu)化中考量的因素。
▲liyang zhang et al., 2021
cas9:sgrna比例測試
對于cas9蛋白和sgrna形成的蛋白復(fù)合物，以何種比例添加進(jìn)行孵育轉(zhuǎn)染必定也是重要的因素。在大多數(shù)的出版物中，cas9:grna的比值在1:1.2 - 1:5之間。
▲akiko seki et al., 2018
electroporation enhancer
有時(shí)可以考慮使用electroporation enhancer以實(shí)現(xiàn)更高的編輯效率。
▲matteo martufi et al., 2019
市面上大多數(shù)提供cas蛋白或sgrna的供應(yīng)商通常也會(huì)提供一份詳細(xì)的protocol，可以優(yōu)先參考這些protocol或相關(guān)的paper。除上面提到的方向外，供體差異，轉(zhuǎn)染的時(shí)間點(diǎn)，對于免疫細(xì)胞(如t細(xì)胞)，何種激活劑激活也可能會(huì)對最終的結(jié)果造成影響。