摘要：多酚氧化酶(polyphenol oxidase,ppo)是茶樹(camellia sinensis)中普遍存在的一種酶，是紅茶制作中品質(zhì)形成的關(guān)鍵酶類。多酚氧化酶可催化氧化兒茶素類物質(zhì)形成茶黃素類(tfs)色素，而后者對(duì)紅茶色、香、味等品質(zhì)形成具有關(guān)鍵作用。
關(guān)鍵詞：紅茶；茶黃素；多酚氧化酶
多酚氧化酶是一類末端氧化酶，酶分子由主酶和金屬輔基組成。多酚氧化酶在自然界中分布極廣，廣泛存在于植物體內(nèi)，能夠催化氧化多酚類物質(zhì)生成醌，在茶樹生理代謝及茶葉加工等過程中對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)形成有極為重要的作用，也是植物葉子、果實(shí)等褐變的主要作用酶類。茶樹多酚氧化酶(polyphenol oxidase，ppo)的研究始于19世紀(jì)末20世紀(jì)初。茶樹ppo分子量大小為144000±16000，最佳底物為鄰苯二酚，適宜的ph范圍為5～7，最適ph值為5.7(以鄰苯二酚為底物)嘲。多酚氧化酶以其在紅茶加工中的重要作用受到廣泛關(guān)注和研究。本文就多酚氧化酶的分類、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、功能等方面闡述多酚氧化酶的相關(guān)研究。
1 多酚氧化酶的分類
根據(jù)多酚氧化酶催化底物的不同，多酚氧化酶分為單酚氧化酶(酪氨酸酶，tyrosinase，ec.1.14.18.1)、雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶，catchol-oxidase，e c.1.10.3.1)和漆酶(laccase，ec.1.10.3.2)等。多酚氧化酶的共同特征是能夠通過有氧氧化酚或多酚類物質(zhì)生成其對(duì)應(yīng)的醌同。酪氨酸酶可有氧催化單羥基酚生成二醌。兒茶酚氧化酶可有氧催化鄰苯二酚生成二醌。漆酶有氧催化苯酚或?qū)Ρ椒由蓪?duì)苯醌。酪氨酸酶和漆酶主要存在于微生物中，兒茶酚氧化酶則主要分布在植物中。酪氨酸酶活性中心有2個(gè)cu2+，與周圍n原子和o原子形成3種不同的狀態(tài)，催化氧化過程分兩步：首先使單酚及其衍生物鄰位羥基化，生成鄰二酚及其衍生物；二是氧化鄰二酚及其衍生物生成相應(yīng)的醌。漆酶的催化氧化作用主要表現(xiàn)在使底物生成自由基和酶分子中cu2+的協(xié)同傳遞電子和價(jià)態(tài)變化。漆酶的催化底物范圍很廣，可以催化單酚、三酚、鄰酚和對(duì)位二酚。此外，漆酶還可催化氧化維生素c、對(duì)苯二胺爭(zhēng)屹。酪氨酸酶和漆酶工程菌已得到成功構(gòu)建并表達(dá)。
兒茶酚氧化酶通常被稱作多酚氧化酶(ppo)，普遍分布于植物體各器官和組織內(nèi)。其含量和活性隨植物體的生長(zhǎng)而不斷變化，分子量大小也因植物種類不同，同一種植物的部位不同、同一部位的多基因家族的控制成員不同而不同，且受植物生長(zhǎng)條件的影響，具有空間和時(shí)間特異性。
按溶解狀態(tài)茶葉ppo分為游離態(tài)和束縛態(tài)兩大類。前者主要存在于細(xì)胞液中，為可溶態(tài)；后者較前者多而且主要存在于葉綠體、線粒體等細(xì)胞器中，并與這些細(xì)胞器膜特異結(jié)合，為不溶態(tài)。
2 多酚氧化酶的細(xì)胞學(xué)定位
ppo是一種質(zhì)體酶，存在于光合植物葉綠體類囊體以及非光合植物的質(zhì)體類囊體中，如根細(xì)胞質(zhì)體、表皮細(xì)胞質(zhì)體、胚軸細(xì)胞質(zhì)體、頂端組織細(xì)胞質(zhì)體等。在光合組織部位中，ppo定位于葉綠體類囊體膜上；在非光合組織部位中，ppo定位于各種質(zhì)體的囊泡中。但具有質(zhì)體的組織細(xì)胞也可能不存在ppo，或者無ppo活性，例如在c4植物葉中，只在葉肉組織中探測(cè)到ppo活性，維管束鞘細(xì)胞盡管葉綠體豐富，卻檢測(cè)不到ppo活性。
3多酚氧化酶酶源及其同工酶
tanaka t．等研究多種供試材料后發(fā)現(xiàn)這些材料勻漿液均可氧化ec和egc形成茶黃素，其中枇杷、日本梨和藍(lán)梅合成茶黃素的能力比茶葉強(qiáng)。吳紅梅用不同材料和不同方法提取ppo并制取茶色素發(fā)現(xiàn)，茶、蘋果、梨的ppo制取茶色素效果為佳。李適用毛栓菌ppo氧化兒茶素，產(chǎn)物中酯型茶黃素比例較高閻。趙淑娟進(jìn)行微生物菌種篩選后得到一株產(chǎn)ppo菌株，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)得其酶活為256u/ml。
茶葉ppo同工酶的研究始于20世紀(jì)六七十年代。buzun等通過聚丙烯酸胺凝膠電泳分離出了6種ppo組分，并測(cè)算出其分子量剛。安徽農(nóng)學(xué)院從福鼎大白茶等材料中分離出ppo同工酶6～7條，它們均可促進(jìn)鄰苯二酚氧化，對(duì)表沒食子兒茶素沒食子酸酯、鄰苯二酚氧化最為顯著閻。劉仲華等從茶鮮葉中分離得到六條同工酶帶，按照遷移率由小到大排列依次為pp01—pp06，其中pp02、pp04、pp06對(duì)多酚類敏感性較強(qiáng)，而ppo1、pp03、ppo5對(duì)多酚類敏感性不強(qiáng)。在催化兒茶素氧化聚合形成茶黃素(tfs)的過程中，各同工酶所起作用由大到小依次為：ppo1、pp03、ppo5、pp02、pp04、pp06。ppo1不僅熱穩(wěn)定性好，也成為最終唯一殘留的ppo組分閉。葛超等研究發(fā)現(xiàn)不同品種梨的ppo同工酶的帶數(shù)、遷移率和區(qū)帶染色情況也存在差異。王坤波研究發(fā)現(xiàn)不同來源ppo同工酶的酶帶相似，但酶帶數(shù)目、rf值及分子量均有差異：梨有11條同工酶帶，蘋果4條，茶葉5條，蘑菇5條，而漆酶只有1條。酶帶rf值集中在0.40—0.70；茶葉ppo同工酶的相對(duì)分子量大于94kda。并分析比較得出不同來源ppo合成茶黃素能力由大到小為：梨ppo，茶葉ppo，微生物ppo，蘋果ppo，漆酶ppo，蘑菇ppo。在所有供試?yán)嫫贩N中，豐水梨ppo同工酶譜帶最多，酶活性最大，合成茶黃素的能力最強(qiáng)閉。
4多酚氧化酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
現(xiàn)有研究表明ppo定位于質(zhì)體膜上。ppo首先在細(xì)胞質(zhì)中合成含有轉(zhuǎn)運(yùn)肽（導(dǎo)肽）的前體肽，導(dǎo)肽引導(dǎo)ppo進(jìn)入質(zhì)體后被切除，ppo成為有活性的成熟蛋白。導(dǎo)肽通常位于n末端，含有80~90個(gè)氨基酸，蛋白酶切割的位點(diǎn)一般是丙氨酸一絲氨酸或丙氨酸一丙氨酸之間。導(dǎo)肽n端含大量的親水性氨基酸殘基，c端約有50%疏水氨基酸殘基。在ppo的c端非編碼區(qū)還含有一些糖類，可能對(duì)維持ppo的正確構(gòu)象起作用。植物ppo具有高度的同源性，功能活性部位都有兩個(gè)富含組氨酸(his)的銅離子結(jié)合區(qū)(cua和cub)，cua區(qū)和cub區(qū)各有3個(gè)保守的his，通過配位鍵形成特定的空間三維結(jié)構(gòu)。klabunde對(duì)成熟ppo進(jìn)行晶體衍射研究印證了銅離子與組氨酸共價(jià)結(jié)合，其中h88.h109.h218與cua共價(jià)結(jié)合，cub與hzlo.h244.h274共價(jià)結(jié)合。
5多酚氧化酶的基因結(jié)構(gòu)
借助基因工程技術(shù)對(duì)ppo基因研究至今，番茄、蠶豆、煙草、甘蔗、杏、美洲商陸、葡萄、日本梨、桃等的ppo基因已被克隆。對(duì)已克隆的植物ppo基因分析發(fā)現(xiàn)ppo是由核基因編碼表達(dá)，多基因控制的蛋白酶，具有基因家族的特性。大多ppo由多個(gè)基因編碼，多則6～7個(gè)基因，少則2—3個(gè)。但對(duì)葡萄ppo基因研究發(fā)現(xiàn)，葡萄ppo是由單個(gè)基因編碼表達(dá)。趙東以已發(fā)表的ppo基因中的保守序列設(shè)計(jì)引物克隆得到茶樹ppo基因部分序列，發(fā)現(xiàn)茶樹ppo基因與其它植物的ppo基因同源性較高，尤其是銅結(jié)合部位序列基本一致。
與其他真核基因不同，已克隆的番茄、蠶豆、煙草、甘蔗、杏、美洲商陸、葡萄、日本梨、桃等的ppo基因均不含內(nèi)含子。陳忠正等以英紅9號(hào)茶葉為材料，克隆得到ppo基因全長(zhǎng)序列，發(fā)現(xiàn)茶樹ppo基因也沒有內(nèi)含子。郝欣以福鼎大白等茶葉為材料，分別從基因組dna和rna人手，克隆得到ppo基因全長(zhǎng)序列，兩種產(chǎn)物的核酸序列一致，同樣說明茶樹ppo基因不含內(nèi)含子網(wǎng)。但研究發(fā)現(xiàn)香蕉、菠蘿等ppo基因中有小片段內(nèi)含子。
6 多酚氧化酶的生理功能
6.1 多酚氧化酶與紅茶品質(zhì)的關(guān)系
ppo作為紅茶發(fā)酵中的關(guān)鍵酶，對(duì)茶葉品質(zhì)的形成至關(guān)重要，對(duì)茶葉適制性有很大的影響。茶葉中ppo含量高、活性大，有利于紅茶品質(zhì)形成與積累，適制紅茶；反之則適制綠茶。紅茶在發(fā)酵過程中利用茶葉自身酶系發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，形成紅茶特有的色、香、味。綠茶加工需要?dú)⑶?，要高溫使ppo迅速失活，失去酶促氧化功能以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)綠茶；而在紅茶加工中則需要ppo充分發(fā)揮其酶促氧化功能，催化兒茶素類物質(zhì)氧化形成茶色素類物質(zhì)。兒茶素類底物氧化觸發(fā)了一些香氣前體物質(zhì)的偶聯(lián)氧化，生成各種各樣的香氣成分，從而形成紅茶特有的品質(zhì)。
竹尾忠一研究紅茶制造中ppo的活性變化后發(fā)現(xiàn)鮮葉中ppo活性在茶葉萎凋過程中逐漸增加，酶活性隨萎凋溫度提高而有較快增長(zhǎng)。不論輕萎凋或重萎凋，ppo活性均有快速增加。但另有研究表明ppo活性隨茶鮮葉的失水而活性降低，適當(dāng)補(bǔ)充水分后，ppo活性又得到恢復(fù)。劉仲華等研究發(fā)現(xiàn)，ppo活性隨萎凋過程中茶葉失水而提高，含水量為65%左右時(shí)活性達(dá)到頂峰，但進(jìn)一步過度萎凋使ppo活性降低?？傊?，萎凋過程中ppo活性的提高有重要的意義，是紅茶制作工序中的關(guān)鍵步驟。
紅茶發(fā)酵過程中添加外源ppo可提高發(fā)酵葉中的ppo活性，有利于紅茶的發(fā)酵，提高茶黃素含量，改善紅茶湯色，增加紅茶香氣。七十年代開始，國(guó)內(nèi)外利用ppo加速茶葉發(fā)酵制作高品質(zhì)速溶紅茶并取得顯著效果。馬鈴薯、無花果、葡萄甚至是某些種屬的真菌中的ppo應(yīng)用到紅茶制造中也均有利于紅茶茶黃素的積累，使紅茶茶湯顏色加深，香氣加高，品質(zhì)得到相應(yīng)提高。在黑茶和白茶加工中ppo均進(jìn)行了不同程度的催化反應(yīng)，有利于形成各自特有的品質(zhì)特征。
應(yīng)用茶鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵工藝生產(chǎn)紅茶，在發(fā)酵方式上較傳統(tǒng)發(fā)酵工藝有所變化。夏濤研究茶鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)，懸浮發(fā)酵中ppo活性受到抑制，但仍能正常催化兒茶素類底物生成茶黃素類物質(zhì)。懸浮發(fā)酵體系中添加有機(jī)溶劑可增加溶氧，明顯促進(jìn)ppo氧化兒茶素類底物生成茶黃素。
6.2 多酚氧化酶的其他功能
光合植物中ppo定位于葉綠體類囊體膜上，由此推測(cè)ppo可能與植物光合作用有關(guān)，ppo可能對(duì)光合作用進(jìn)行反向調(diào)節(jié)并參與構(gòu)成電子傳遞鏈和能量轉(zhuǎn)換[44,45]。通過對(duì)金魚草素合成酶的研究發(fā)現(xiàn)，金魚草素合成酶以查耳酮為特異底物，催化生成橙酮，而后者是花色素形成的主要原因，金魚草素合成酶與ppo的結(jié)構(gòu)極為相似，由此推測(cè)ppo可能參與花色素的形成。此外有研究表明ppo還與植物體中乙烯的形成等生長(zhǎng)發(fā)育過程有關(guān)。
ppo參與植物體的損傷免疫應(yīng)答。植物組織受損傷時(shí)，ppo增加表達(dá)量，與酚類底物作用生成酮，酮與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合降低了親核氨基酸的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)能力，從而可抵御病蟲危害，促進(jìn)傷口的愈合。但ppo在病蟲害等傷害中的作用機(jī)制尚未完全闡明，有待深入研究。此外，對(duì)真菌的ppo研究后發(fā)現(xiàn)，真菌ppo可以降解木質(zhì)素，聚合木質(zhì)素的氧化產(chǎn)物。
7展望
作為紅茶制造中的關(guān)鍵酶類，ppo對(duì)紅茶品質(zhì)的形成有至關(guān)重要的作用。選擇ppo含量高、活性高的茶葉資源生產(chǎn)紅茶，有利于提高紅茶的品質(zhì)，拓展紅茶市場(chǎng)。國(guó)內(nèi)外嘗試紅茶制造中添加外源ppo對(duì)紅茶發(fā)酵進(jìn)行改善并取得了重要進(jìn)展。速溶紅茶制作時(shí)，添加ppo可提高紅茶制取率，增加可溶性物質(zhì)的含量，減輕紅茶的苦澀味，顯著提高了速溶紅茶的品質(zhì)。茶黃素作為紅茶中的主要品質(zhì)因子，在抑菌、抗病毒、降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗突變、抗衰老、抗癌防癌等方面也卓有成效，已有抗齲齒牙膏等多種產(chǎn)品面市。但由于茶葉本身ppo含量不高，生產(chǎn)的紅茶中茶黃素含量也相應(yīng)較低，而且提取制備復(fù)雜，產(chǎn)品純度低、成本高，難以規(guī)?；a(chǎn)。如何以兒茶素類物質(zhì)為原料，篩選活性高的ppo應(yīng)用于紅茶生產(chǎn)、茶黃素合成、速溶茶生產(chǎn)，具有重要的實(shí)際意義。
基因工程技術(shù)的發(fā)展和茶葉研究的深入使得二者能夠結(jié)合起來。應(yīng)用基因工程技術(shù)，克隆高活性的ppo基因，構(gòu)建表達(dá)工程菌，獲得工程蛋白酶，應(yīng)用于紅茶生產(chǎn)，有利于提高紅茶品質(zhì)，而且可廣泛應(yīng)用于紅茶加工、茶黃素生產(chǎn)等方面，這也將推動(dòng)我國(guó)紅茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
應(yīng)用基因工程技術(shù)可獲得茶樹優(yōu)良種質(zhì)資源。黃建安等采用pcr-sscp分析與個(gè)體dna測(cè)序相結(jié)合的方法研究茶樹ppo基因，并對(duì)酶切位點(diǎn)變異作進(jìn)一步的pcr-rflp分析，探討了snp與茶樹品種適制性及遺傳背景的關(guān)聯(lián)性，并指出hpaⅱ酶切位點(diǎn)在引物l7/l8擴(kuò)增區(qū)段多態(tài)性較豐富，適制紅茶的品種多為aa基因型，此位點(diǎn)能被hpaⅱ完全酶切?；蛑亟M技術(shù)促進(jìn)了ppo基因的克隆與體外表達(dá)。番茄、蘋果的ppo基因在大腸桿菌中已得到表達(dá)，但表達(dá)產(chǎn)物不具有活性。李桂琴等對(duì)鴨梨ppo基因編碼區(qū)序列進(jìn)行了克隆及表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有酶活性，但活性較低。其原因可能有：一是由于大腸桿菌自身的保護(hù)機(jī)制，自身的蛋白酶將外源表達(dá)蛋白視為異物而將其降解，導(dǎo)致無目的蛋白積累；二是ppo活性的發(fā)揮需要銅離子結(jié)合并形成正確的三維結(jié)構(gòu)，但由原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏翻譯后加工過程，表達(dá)的蛋白并未正確折疊，而是形成包含體，導(dǎo)致酶的活性比較低。此外，在原核表達(dá)系統(tǒng)dna轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中稀有密碼子缺少、堿基錯(cuò)配、突變等原因均有可能造成蛋白無表達(dá)或無活性。吳貽良用成熟ppo基因構(gòu)建表達(dá)載體，經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)后得到部分可溶性蛋白，但大部分為不可溶蛋白，將蛋白復(fù)性后，所得酶活為20.12u/mg;又把成熟ppo基因分別克隆人非分泌型載體ppicza和分泌型載體ppiczaa，在畢赤酵母gs115表達(dá)后測(cè)其酶活分別為29.12u/mg和26.92u/mg閣。因此，如何獲得高表達(dá)高活性的ppo基因，如何解決原核表達(dá)系統(tǒng)的包含體問題，以及如何提高ppo基因體外表達(dá)蛋白的活性是未來研究的核心問題。
相比較常規(guī)游離酶制劑，固定化酶技術(shù)有著顯著的優(yōu)越性：穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等。國(guó)內(nèi)外固定化ppo的方法主要有包埋法和吸附一交聯(lián)法等。在優(yōu)質(zhì)紅茶、茶黃素生產(chǎn)中，為了更有效地利用ppo，ppo固定化研究也將受到越來越多的關(guān)注。