中華人民共和國國家標準
gb 31656.6-2021
食品安全國家標準
水產(chǎn)品中丁香酚殘留量的測定
氣相色譜-質(zhì)譜法
national food safety standard-
determination of eugenol residues in aquatic products by
gas chromatography mass spectrometry method
1范圍
本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中丁香酚殘留量檢測的制樣和氣相色譜質(zhì)譜測定方法。
本文件適用于魚、蝦可食組織中丁香酚殘留量的檢測。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可（ke）少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
gb/t 30891-2014水產(chǎn)品抽樣規(guī)范
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4原理
試樣中殘留的丁香酚經(jīng)乙腈提取，固相萃取柱凈化，正己烷除脂，氣相色譜質(zhì)譜法測定，內(nèi)標法定量。
5試劑和材料
除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合gb/t 6682規(guī)定的一級水。
5.1試劑
5.1.1乙腈（ch3cn）：色譜純。
5.1.2正己烷（c6h14）：色譜純。
5.1.3乙酸乙酯（ch3cooch2ch3）：色譜純。
5.1.4甲醇（ch3oh）：色譜純。
5.2溶液配制
5.2.1甲醇溶液：取甲醇10 ml，加水至100 ml。
5.2.2乙腈飽和正己烷：取正己烷200 ml于250 ml分液漏斗，加適量乙腈，劇烈振搖，待分配平衡后，棄去下層乙腈層，即得。
5.3標準品
5.3.1丁香酚（eugenol，c10 h12o2，cas號：97-53-0），含量≥99%。
5.3.2氘代丁香酚（eugenol-d3，c10h9d3o2，cas號：1335401-17-6），含量≥99%。
5.4標準溶液配制
5.4.1丁香酚標準儲備液：取丁香酚標準品10 mg，精密稱定，用乙酸乙酯溶解并定容于100 ml棕色容量瓶，制成濃度為100μg/ml標準儲備液。-18℃以下避光保存，有效期2個月。
5.4.2內(nèi)標儲備液：取氘代丁香酚標準品10 mg，精密稱定，用乙酸乙酯溶解并定容于100 ml棕色容量瓶，制成濃度為100μg/ml的內(nèi)標儲備液。-18℃以下避光保存，有效期2個月。
5.4.3丁香酚標準工作液：準確移取丁香酚標準儲備液適量，用乙酸乙酯稀釋為濃度1μg/ml的標準工作液。4℃下避光保存，有效期1個月。
5.4.4內(nèi)標工作液：取內(nèi)標儲備液適量，用乙酸乙酯稀釋濃度約為1μg/ml的標準工作液。4℃下避光保存，有效期1個月。
5.5材料
5.5. 1固相萃取柱（c18）：300mg/3ml，或相當者。
5.5.2具塞塑料離心管：50 ml。
5.5.3尼龍微孔濾膜：0.22μm。
6儀器與設(shè)備
6.1氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電子轟擊電離離子源。
6.2分析天平：感量0.01 g和感量0. 0001 g。
6.3氮吹儀。
6.4渦旋混合器。
6.5離心機：4 000 r/min。
6.6超聲波振蕩器。
6.7均質(zhì)機。
7試料的制備與保存
7.1試料的制備
按gb/t 30891-2014中附錄b的要求制樣。
a）取均質(zhì)的供試樣品，作為供試試料；
b）取均質(zhì)的空白樣品，作為空白試料；
c）取均質(zhì)的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試料。
7.2試料的保存
-18℃以下保存。
8測定步驟
8.1提取
取試料約2 g（準確至±0.02 g），于50 ml具塞塑料離心管中，加內(nèi)標工作液0.1 ml、乙腈10 ml，渦旋1 min，超聲10 min，4 000 r/min離心5 min。取上層液于另一50 ml具塞塑料離心管中，殘渣用乙腈10 ml重復(fù)提取一次，合并上清液。加乙腈飽和正己烷10 ml，脫脂，渦旋，1 min，4000 r/min離心5 min，取乙腈層，按上述方法重復(fù)脫脂一次。45℃水浴氮氣吹至近干，加甲醇水溶液10 ml使溶解，備用。
8.2凈化
固相萃取柱依次用甲醇、水各3 ml活化。取備用液過柱，加水3 ml淋洗，抽干5 min，加甲醇3 ml洗脫，取洗脫液，氮氣吹干。加乙酸乙酯1.0 ml使溶解，0.22μm濾膜過濾，氣相色譜質(zhì)譜測定。
8.3標準曲線的制備
精密量取丁香酚標準工作液、內(nèi)標工作液適量，用乙酸乙酯稀釋成濃度為4μg/l、10μg/l、40μg/l、100μg/l、400μg/l、800μg/l系列標準工作液。標準工作液中氘代丁香酚的含量均為100μg/l?，F(xiàn)用現(xiàn)配。取系列標準工作液進樣，以丁香酚和氘代丁香酚峰面積比值為縱坐標、對應(yīng)丁香酚濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。
8.4測定
8.4.1氣相色譜參考條件
a）進樣針：10.0μl，或相當者；
b）色譜柱：毛細管柱（填料：5%-苯基甲基聚硅氧烷，如hp-5，規(guī)格：30m×250μm×0.25μm），或相當者；
c）進樣方式：不分流進樣；
d）載氣：氦氣，純度99. 999%，流速1.0 ml/min；
e）進樣量：2.0μl；
f）進樣口溫度：280℃；
g）柱溫：起始溫度70℃，保持1 min；以40℃/min升溫至120℃，以10℃/min升溫至170℃，保持3 min。
8.4.2質(zhì)譜參考條件
a）離子源：ei源；
b）電子能量：70 ev；
c）離子源溫度：280℃；
d）四級桿溫度：150℃；
e）接口溫度：280℃；
f）后運行溫度：280℃，3 min；
g）溶劑延遲：4.0 min；
h）測定方式：多反應(yīng)（mrm）監(jiān)測模式，定性離子對、定量離子對和保留時間參考值詳見表1。
8.4.3測定法
取試料溶液和標準溶液，作單點或多點校準，以色譜峰面積定量，內(nèi)標法計算。標準溶液及試料溶液中目標化合物的特征離子質(zhì)量色譜峰面積均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。試料溶液中丁香酚的特征離子質(zhì)量色譜峰面積均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。試樣溶液中的相對離子豐度與標準溶液中的相對離子豐度相比，符合表2的要求。標準溶液特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄a。
8.5空白試驗
取空白試料，除不加標準溶液外，采用相同的測定步驟進行平行操作。
9結(jié)果計算和表述
試樣中待測藥物的殘留量按標準曲線或公式（1）計算。
式中：
x——試樣中丁香酚殘留量的數(shù)值，單位為微克每千克（μg/kg）；
a——試樣溶液中丁香酚的峰面積；
ais——試樣溶液中內(nèi)標的峰面積；
as——標準溶液中丁香酚的峰面積；
a'is——標準溶液中內(nèi)標的峰面積；
cis——試樣溶液中內(nèi)標濃度的數(shù)值，單位為微克每升（pg/l）；
cs——標準溶液中丁香酚濃度的數(shù)值，單位為微克每升（μg/l）；
c'is——標準溶液中內(nèi)標濃度的數(shù)值，單位為微克每升（μg/l）；
v——定容體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
10檢測方法靈敏度、準確度和精密度
10.1靈敏度
本方法的檢測限為2.5μg/kg，定量限為10μg/kg。
10.2準確度
本方法在10μg/kg~200μg/kg添加濃度水平上的回收率為70%~ 120%。
10.3精密度
本方法批內(nèi)相對標準偏差≤20%，批間相對標準偏差≤20%。