核酸的分子組成；
dna的一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能；
幾種主要rna(mrna、trna)的結(jié)構(gòu)與功能；
dna的理化性質(zhì)及應(yīng)用。
重點(diǎn)：dna的二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)；dna的變性復(fù)性特點(diǎn)及此特點(diǎn)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用是。
基本知識(shí)與理論：
一、核酸的化學(xué)組成
核酸是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子。包括兩類(lèi)：一類(lèi)為脫氧核糖核酸（dna），另一類(lèi)為核糖核酸（rna）。dna存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)，攜帶遺傳信息；rna存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，參與細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的表達(dá)。核酸的基本組成單質(zhì)是核苷酸，而核苷酸又是由堿基、戊糖、磷酸組成。
(一)堿基
構(gòu)成核苷酸的堿基主要有五種，分屬嘌呤和嘧啶兩類(lèi)。嘌呤類(lèi)化合物包括腺嘌呤a和鳥(niǎo)嘌呤g兩種。嘧啶類(lèi)化合物有三種，胞嘧啶c和胸腺嘧啶t尿嘧啶u。嘌呤和嘧啶環(huán)中均含有共軛雙鍵，因此對(duì)波長(zhǎng)260nm左右的紫外光有較強(qiáng)吸收，這一性質(zhì)可用于對(duì)核酸、核苷酸、及堿基進(jìn)行定性定量分析。
(二)戊糖與核苷、核苷酸
戊糖是核苷酸的另一個(gè)主要成分，rna和dna主要區(qū)別有兩點(diǎn)：一是構(gòu)成dna的堿基為a、t、g、c，而rna的堿基為a、u、c、g，二是構(gòu)成dna的核苷酸的戊糖是β-d－2-脫氧核糖，而構(gòu)成dna的核苷酸的戊糖為β-d—核糖。即rna糖環(huán)上2號(hào)碳原子處連的是-oh，而dna此處連的是-h。表示堿基和糖環(huán)上各原子次序時(shí)，在堿基雜環(huán)上標(biāo)以順序1，2，3…；在糖環(huán)上標(biāo)以l′，2′，3′… 以作區(qū)別。堿基與戊糖通過(guò)糖苷鍵連接成核苷。連接位置是c-1′。核苷與磷酸通過(guò)磷酸酯鍵連接成核苷酸連接位置是c-5′。此處可連接一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)磷酸基團(tuán)，稱(chēng)為核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸。體內(nèi)還有一種核苷酸，即c-3′與c-5′與同一磷酸基團(tuán)相連，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。
二、dna的結(jié)構(gòu)與功能
dna與蛋白質(zhì)一樣，也有其一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。
（一） dna的一級(jí)法構(gòu)
指dna分子中核苷酸的排列順序。由于核苷酸的差異主要表現(xiàn)在堿基上，因此也叫做堿基序列。
四種核苷酸按一定排列順序，通過(guò)磷酸二酯鍵連成主要核苷酸鏈，連接都是由前一核苷酸3′-oh與下一核苷酸5′-磷酸基形成3′-5′磷酸二酯鍵，故核苷酸鏈的兩個(gè)末端分別是5′-游離磷酸基和3′-游離羥基，書(shū)寫(xiě)應(yīng)從5′到3′。
（二）dna的二級(jí)結(jié)構(gòu)
即雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，要與蛋白質(zhì)的α-螺旋相區(qū)別。
1．chargaff規(guī)則
dna分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶的含量相等，鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶的含量相等；因此dna中嘌呤與嘧啶的總數(shù)相等：即a＋g=c＋t
2．雙螺旋結(jié)構(gòu)模型
1953年watson和crick正式提出了關(guān)于dna二級(jí)結(jié)
構(gòu)的右手雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，主要內(nèi)容有：
（1）dna分子由兩條反向平行的多聚核苷酸鏈圍繞同
一中心軸盤(pán)曲而成，兩條鏈均為右手螺旋，鏈呈反平行走向，一條走向是5′→3′，另一條是3′→5′。
（2）dna鏈的骨架由交替出現(xiàn)的親水的脫氧核糖基和磷酸基構(gòu)成，位于雙螺旋的外側(cè)，堿基配對(duì)位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)。
（3）兩條多聚核苷酸鏈以堿基之間形成氫鍵配對(duì)而相連，即a與t配對(duì)，形成兩個(gè)氫鍵，g與c配對(duì)，形成三個(gè)氫鍵。堿基相互配對(duì)又叫堿基互補(bǔ)。rna中若也有配對(duì)區(qū)，a是與u以?xún)蓚€(gè)氫鍵配對(duì)互補(bǔ)。
(4)堿基對(duì)平面與螺旋軸幾乎垂直，相鄰堿基對(duì)沿軸轉(zhuǎn)36°，上升0．34nm。每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)含10對(duì)堿基，螺旋的距為3．4nm，直徑是2．0nm。dna兩股鏈之間的螺旋形成凹槽：一條淺的，叫小溝；一條深的，叫大溝。大溝是蛋白質(zhì)識(shí)別dna的堿基序列發(fā)生相互作用的基礎(chǔ)，使蛋白質(zhì)和dna可結(jié)合而發(fā)生作用。dna雙螺旋結(jié)構(gòu)要與pr的相區(qū)別：dna是兩條核苷酸鏈通過(guò)堿基之間氫鍵相連而成，而蛋白質(zhì)的α-螺旋是一條肽鏈自身盤(pán)曲而成，其氫鍵是其內(nèi)部第1位肽鍵的n-h與第四個(gè)肽鍵的羰基氧形成的。
（5）dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要由互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵和堿基堆積力來(lái)維持。堿基堆積力是堿基對(duì)之間在垂直方向上的相互作用，可以使dna分子層層堆積，分子內(nèi)部形成疏水核心，這對(duì)dna結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是很有利的，堿基堆積力對(duì)維持dna的二級(jí)結(jié)構(gòu)起主要作用。
3．dna結(jié)構(gòu)的多樣性
dna右手雙螺旋結(jié)構(gòu)是dna分子在水性環(huán)境和生-理?xiàng)l件下-穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但并不是不變的，當(dāng)改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度或相對(duì)濕度時(shí)，dna結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，除了waston－crick模型（b－dna）外，還存在z－dna和a－dna
（三）dna三級(jí)結(jié)構(gòu)
真核生物dna分子很大，dna鏈很長(zhǎng)，但卻要存在于小小的細(xì)胞核內(nèi)，因此dna必須在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上緊密折疊，這就形成了三級(jí)結(jié)構(gòu)。
1超螺旋——原核生物dna的三級(jí)結(jié)構(gòu)
絕大部分原核生物dna是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙螺旋分子，此環(huán)形分子可再次螺旋形成超螺旋，真核生物線粒體、葉綠體dna也為環(huán)形分子，能形成超螺旋，非環(huán)形dna分子在一定條件下局部也可形成超螺旋。
2.真核細(xì)胞基因組dna
真核細(xì)胞核內(nèi)染色體即是dna高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要表現(xiàn)形式。組蛋白h2a、h2b、h3、h4各兩分子組成組蛋白八聚體。dna雙螺旋纏繞其上構(gòu)成核心顆粒，顆粒之間再以dna和組蛋白h1連成核小體，核小體再經(jīng)多步旋轉(zhuǎn)折疊形成棒狀染色體，存在于細(xì)胞核中。
(四)dna的功能
dna的基本功能就是作為生物遺傳信息復(fù)制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板，是生命遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。
三、rna的結(jié)構(gòu)與功能
rna通常以單鏈形式存在，這與dna雙鏈形成螺旋不同，但也可以有局部的二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。rna分子比dna分子小，它的功能多樣，種類(lèi)較多，主要有信使rna、核蛋白體rna、轉(zhuǎn)運(yùn)rna、小核rna及核不均一rna等。各類(lèi)rna在遺傳信息表達(dá)為氨基酸序列過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。
（一）信使rna（mrna）
在細(xì)胞核內(nèi)以dna單鏈為模板轉(zhuǎn)錄生成hnrna,hnrna經(jīng)過(guò)剪切變?yōu)槌墒斓膍rna,出核后在胞質(zhì)內(nèi)為蛋白質(zhì)合成提供模板。成熟mrna的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：
1具有5′端帽子結(jié)構(gòu)
即在5′端加上一個(gè)7-甲基鳥(niǎo)苷；且原來(lái)第1個(gè)核苷酸c２′也是甲基化，這種mgpppgm即為帽子結(jié)構(gòu)，
2. 3′端多聚腺苷酸尾
在mrna3′端有一段多聚腺苷酸節(jié)段，是在轉(zhuǎn)錄后切掉一段多余的rna后逐個(gè)添加上去的，這個(gè)多聚尾可能與mrna從核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位及mrna的穩(wěn)定性有關(guān)。
3生物體內(nèi)mrna種類(lèi)多，含量少，代謝活躍，在各種rna分子中，mrna半衰期短，這是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成速度的調(diào)控點(diǎn)之一。
(二)核蛋白體rna(rrna)的結(jié)構(gòu)與功能
rrna是細(xì)胞內(nèi)含量多的rna，與核糖體蛋白共同構(gòu)成核糖體——蛋白質(zhì)的合成部位，參與蛋白質(zhì)的合成。核蛋白體由大亞基和小亞基組成。
1.原核生物：小亞基由16srrna和20多種蛋白質(zhì)組成。
大亞基由5s、23srrna與30余種蛋白質(zhì)組成。
2.真核生物：小亞基由18srrna與30余種蛋白質(zhì)組成。
大亞基由5s、5.8s、28srrna和近50種蛋白質(zhì)構(gòu)成。
(三)轉(zhuǎn)運(yùn)rna(trna)的結(jié)構(gòu)與功能
1.trna的一級(jí)結(jié)構(gòu)
trna是細(xì)胞內(nèi)分子量小的一類(lèi)核酸，含有大量稀有堿基：如甲基化的嘌呤、雙氫尿嘧啶、次黃嘌呤和假尿嘧啶核苷。假尿嘧啶核苷與一般的嘧啶核苷區(qū)別在于以雜環(huán)上c-5而非n-1與糖環(huán)c-1′
連成糖苷鍵。trna的作用是攜帶相應(yīng)的氨基酸將其轉(zhuǎn)運(yùn)到核蛋白體上以供蛋白質(zhì)合成。
2.trna的二級(jí)結(jié)構(gòu)
呈三葉草樣二級(jí)結(jié)構(gòu)：一些能局部互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域形成局部對(duì)鏈，不能配對(duì)的部分膨出成環(huán)狀。此結(jié)構(gòu)從5′末端起第1個(gè)環(huán)為二氫尿嘧啶環(huán)（tφ），第二個(gè)環(huán)為反密碼子環(huán)，因其環(huán)中部的三個(gè)堿基可與mrna中三聯(lián)體密碼子形成堿基互補(bǔ)配對(duì)，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中解讀密碼子，把正確的氨基酸引入合成位點(diǎn)。第三個(gè)環(huán)為假尿嘧啶環(huán)（dhu），所有trna3′末端為cca-oh結(jié)構(gòu)，與氨基酸在此縮合成氨基酰-trna，起到轉(zhuǎn)運(yùn)氨基的作用。
3．trna的三級(jí)結(jié)構(gòu)
trna的三級(jí)結(jié)構(gòu)呈倒l形，t與dhu在二級(jí)結(jié)構(gòu)上各處一方，但在三級(jí)結(jié)構(gòu)上卻相距很近，維系trna三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是依賴(lài)核苷酸之間形成的各種氫鍵。
（四）其他類(lèi)型的rna
如小核rna（snrna）參與hnrna的加工。還有一類(lèi)rna分子本身具有自我催化功能，可完成rrna的剪接。這種具有催化作用的rna被稱(chēng)為核酶。要與核酸酶區(qū)別，后者是指可水解核酸的酶，故按照底物不同可分為dna酶和rna酶。
四、核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用
（一）核酸的一般理化性質(zhì)
①核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性。②dna是線性高分子，粘度極-大，在機(jī)械力作用下易斷裂，因此提取dna過(guò)程中應(yīng)注意不能過(guò)度用力，比如劇烈震蕩吹打等。③由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在紫外260nm波長(zhǎng)處有大吸收峰，這個(gè)性質(zhì)可用于核酸的定量測(cè)定。這要與pr在280mm波長(zhǎng)處有大的吸收峰相區(qū)別，又因?yàn)榉肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)核酸提取過(guò)程中，蛋白質(zhì)是-常見(jiàn)的雜質(zhì)，故常用ud260/ud280來(lái)檢測(cè)提取的核酸純度如何。
（二) dna的變性、復(fù)性和雜交
1．變性，這是dna重要的一個(gè)性質(zhì)。
①dna雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級(jí)鍵，能量較低，易受破壞，在某些理化因素作用下，dna分子互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使dna雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即為dna變性。dna變性只涉及二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，不伴隨一級(jí)共價(jià)鍵的斷裂。②監(jiān)測(cè)dna是否變性的一個(gè)-常用的指標(biāo)是dna在紫外區(qū)260nm波長(zhǎng)處的吸收光值變化。因?yàn)閐na變性時(shí)，dna雙鏈發(fā)生解離，共軛雙鍵更充分暴露，故dna變性，dna在260nm處的吸收光度值增加，并與解鏈程度有一定的比例關(guān)系，這種關(guān)系叫做dna的增色效應(yīng)。③dna的變性從開(kāi)始到解鏈*，是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值增加達(dá)到大增加值的50％時(shí)的溫度叫做dna的解鏈溫度（tm）。一種dna分子的 tm值的大小與其所含堿基中的 g＋c的比例相關(guān)也與dna分子大小及變性條件有關(guān)，g+c的比例越高，dna分子越長(zhǎng)，溶液離子強(qiáng)度越高，tm值越大。④加熱、低鹽及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿均可使dna變性。
2．復(fù)性
變性dna在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈可重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱(chēng)為復(fù)性。熱變性的dna經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過(guò)程也叫退火，一般認(rèn)為，比tm值低25℃的溫度是dna復(fù)性的-佳條件。
3．dna復(fù)性的實(shí)際應(yīng)用——雜交：通過(guò)變性dna的復(fù)性性質(zhì)，我們可知道，dna單鏈之間、rna單鏈之間、一條dna和一條rna鏈之間只要存在序列互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域，不管是整條鏈互補(bǔ)，還是部分序列互補(bǔ)，即可重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，這即為核酸分子雜交，這在分子生物學(xué)研究中有極-大的應(yīng)用，比如：可用于在基因組中對(duì)特異基因的定位及檢測(cè)，pcr技術(shù)擴(kuò)增目的基因等，很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用的都是核酸分子雜交的原理，如southern blot, northern blot,包括pcr技術(shù)等。
五、核酸酶
指水解核酸的酶，根據(jù)底物不同分dna酶、rna酶，根據(jù)作用位點(diǎn)不同分核酶外切酶和核酸內(nèi)切酶，其中限制性核酸內(nèi)切酶在分子生物學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用尤為重要。