無菌檢查法（2005年版 一部）
附錄ⅹⅲb. 無菌檢查法
無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。
無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程中必須嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。
培 養(yǎng) 基
培養(yǎng)基的制備
培養(yǎng)基可按以下**制備，也可使用按該**生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應采用驗證合格的**程序**。制備好的培養(yǎng)基應保存在2~25℃、避光的環(huán)境。培養(yǎng)基若保存于非密閉容器中，一般在三周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使用。
1.硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)好氧菌、厭氣菌)
酪胨（*水解） 15g 氯化鈉 2.5g
葡萄糖 5g 新配制的0.1％刃天青溶液 1.0ml
l-* 0.5g
硫乙醇酸鈉 0.5g 瓊脂 0.75g
(或硫乙醇酸0.3ml) 水 1000ml
酵母浸出粉 5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解后，調(diào)節(jié)ph為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)ph值使**后為7.1±0.2，分裝*適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養(yǎng)結束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。**。在供試品接種前, 培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則,須經(jīng)100℃水浴加熱*粉紅色消失（不超過20分鐘）迅速冷卻,只限加熱一次，并應防止被污染。
硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30~35℃培養(yǎng)。
2.改良馬丁培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)**）
胨 5.0g * 1.0g
酵母浸出粉 2.0g * 0.5g
葡萄糖 20.0g 水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph值約為6.8，煮沸,加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)ph值使**后為6.4±0.2，分裝，**。
改良馬丁培養(yǎng)基置23~28℃培養(yǎng)。
3.選擇性培養(yǎng)基
按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的**及制法，在培養(yǎng)基**或使用前加入適量的中和劑或表面活性劑，如聚山梨酯80（用于非水溶性供試品）等。中和劑或表面活性劑的用量應通過驗證。
4.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基
胨 10g 牛肉浸出粉 3.0g
氯化鈉 5g 水 1000ml
取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)ph為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)ph值使**后為7.2±0.2，分裝，**。
5.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
按上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的**及制法，加入14.0g瓊脂，調(diào)節(jié)ph值使**后為7.2±0.2，分裝，**。
6.改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基
按改良馬丁培養(yǎng)基的**及制法，加入14.0g瓊脂，調(diào)節(jié)ph值使**后為6.4±0.2，分裝，**。
培養(yǎng)基的適用性檢查
無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。
無菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應無菌生長。
靈敏度檢查。
菌種 培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。
*（staphylococcus aureus)［cmcc（b） 26 003］
銅綠假單胞菌 (pseudomonas aeruginosa) ［cmcc（b） 10 104］
枯草芽孢桿菌 (bacillus subtilis ) ［cmcc（b） 63 501］
生孢梭菌 (clostridiumsporogenes) [cmcc(b) 64 941]
白色*** (candidaalbicans) [cmcc(f) 98 001]
黑曲霉 (aspergillus niger ) [cmcc(f) 98 003]
菌液制備 接種*、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物*營養(yǎng)肉湯獲營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物*硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)18~24小時；接種白色念株菌的新鮮培養(yǎng)物*改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，23~28℃培養(yǎng)24~48小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物*改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23~28℃培養(yǎng)5~7天，加入3~5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）*無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu 的孢子懸液。
培養(yǎng)基接種 取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的*、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu 的白色念株菌、黑曲霉各2支，另1支不接種 作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結果。
結果判斷 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管菌生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。
稀釋液、沖洗液及其制備方法
稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的**程序**。
1. 0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000 ml，微溫溶解，濾清，調(diào)節(jié)ph值*7.1±0.2，分裝，**。
2.ph7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀3.56g、*7.23 g、氯化鈉4.30g 、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，**。
如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的**前或**后加入表面活性劑或中和劑等。
方法驗證試驗
當建立藥品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應重新驗證。
驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一對試驗菌應逐一進行驗證。
菌種及菌液制備 同培養(yǎng)基靈敏度檢查。
薄膜過濾法 將規(guī)定量的供試品薄膜過濾法過濾，沖洗，在*后 一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種*硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或將培養(yǎng)基加*濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按規(guī)定溫度培養(yǎng)3~5天。各試驗菌同法操作。
直接接種法 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的*、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100cfu的白色念株菌、黑曲霉各2管。其中1管接入規(guī)定量的供試品，另1管作為對照品，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)3~5天。
結果判斷 與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量，或使用中和劑或更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。
方法驗證試驗夜可與供試品的無菌檢查同時進行。
供試品的無菌檢查
檢驗數(shù)量 檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品*小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表1規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢查按表2、表3規(guī)定。表1、表2、表3中*少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗的供試品用量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加1/2的*小檢驗數(shù)量作陽性對照用；若采用直接接種法，應增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。
檢驗量 使指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。除另有 規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種供試品的量按表2、表3規(guī)定。采用直接接種法時，若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應不少于直接接種法的供試品總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。
陽性對照 應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗**的供試品，以*為對照菌；抗***的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗**的供試品，以白色念株菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48~72小時應生長良好。
陰性對照 供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物生長及存活無影響。
無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。進行供試品無菌檢查時，所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。
操作時，用適宜的**液對供試品容器表面進行***。如果容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有**過濾器的針頭），向供試品容器內(nèi)導入無菌空氣，再按無菌操作開啟容器取出內(nèi)容物。
供試品處理及接種培養(yǎng)基
除另有規(guī)定外，按下列方法進行。
1.薄膜過濾法
薄膜過濾法應優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，也可使用 一般薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45um，直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法**。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。
水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的*大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，且總沖洗量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。
水溶液供試品 取規(guī)定量，直接過濾，或混合*含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應的濾筒內(nèi)。如采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中一份做陽性對照用。
可溶于水的固體制劑供試品 取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明復溶，然后照水溶液供試品項下的方法操作。
非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量，直接過濾；或混合溶于含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含0.1%~1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜*少三次。濾膜于含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基接種照水溶液供試品項下的方法操作。
可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品 取規(guī)定量，混合*適量的無菌十四烷酸異丙酯中，劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果需要可適當加熱，但溫度不得超過44℃，趁熱迅速過濾。若無法過濾，應加 入不少于1000ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后濾膜沖洗及培養(yǎng)基接種照非水溶性制劑供試品項下的方法操作。
無菌氣（噴）霧劑供試品 取規(guī)定量，將各容器置冰室冷凍約1小時。以無菌操作迅速在容器上端鉆一小孔，釋放拋射劑后再無菌開啟容器，然后照水溶液或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。
裝有**的注射器供試品 取規(guī)定量，裝上無菌針頭（非包裝中所佩帶的），若需要可吸入稀釋液或用標簽所示的溶劑溶解，然后照水溶液或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。同時應采用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。
2. 直接接種法
直接接種法即每支（或瓶）供試品按規(guī)定量分別接種*各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個容器中的培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證試驗；每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗數(shù)量。
混懸液等非澄清水溶液供試品 取規(guī)定量接種*各管培養(yǎng)基中。
固體制劑供試品 取規(guī)定量直接接種*各管培養(yǎng)基中，或加入適宜的稀釋液溶解，或按標簽說明復溶后，取規(guī)定量接種*各管培養(yǎng)基中。
非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其他適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種*各管培養(yǎng)基中。或直接接種*聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的各管培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)及觀察
上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)基液適量轉種*同種新鮮培養(yǎng)基中或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，**培養(yǎng)2天、**培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面是否有菌生長；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。
結 果 判 斷
若供試品均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列*少一個條件時，方可判試驗結果無效：
（1）無菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結果不符合無菌檢查法的要求；
（2）回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。
（3）陰性對照管有菌生長；
（4）供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌 試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。
試驗若經(jīng)確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。
表1 批出廠產(chǎn)品*少檢驗數(shù)量
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供試品 批產(chǎn)量n（個） 每種培養(yǎng)基*少檢驗數(shù)量
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注射劑
≤100 10%或4個（取較多者）
100〈n≤500 10個
〉500 2%或20個（取較少者）
大體積注射劑（＞100ml） 2%或10個（取較少者）
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眼用及其他非注射產(chǎn)品
≤200 5%或2個（取較多者）
＞200 10個
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桶裝固體原料
≤4 每個容器
4〈n≤50 20%或4個容器（取較大者）
＞50 2%或10個（取較大者）
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注：若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的檢驗數(shù)量應加倍。
表2 上市抽驗樣品（液體制劑）的*少檢驗量
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供試品裝量v（ml） 每支樣品接入每管 *少檢驗數(shù)量
培養(yǎng)基的*少樣品量 （瓶或支）
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≤1 全量 20 ①
1＜v＜5 半量 10
5≤v＜20 2ml 10
20≤v＜50 5ml 10
50≤v＜100 10ml 10
50≤v＜100（靜脈給藥） 半量 10
100≤v≤500 半量 6
v＞500 500ml 6
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①每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。
表3 上市抽驗樣品（固體制劑）的*少 檢驗量
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供試品裝量m 每支樣品接入每管培 *少檢驗數(shù)量
/支、瓶或個 養(yǎng)基的*少樣品量 （瓶或支）
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m＜50mg 全量 20①
50mg≤v＜300mg 半量 10
300mg≤v＜5g 150mg 10
m≥5g 500mg 10②
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①每種培養(yǎng)基各接種10支供試品。
②桶裝固體原料的*少檢驗數(shù)量為4個包裝