（□sayyes提供）
李榮林方輝遂
(浙江農業(yè)大學茶學系310029)
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abstract
the investigation on polyphenol oxidase intea sphere has been startedsince the blackteafermentation.yhe tea fermentation was historicalyconsidered as the action of microorganisms.afterthen,it was gradually revealledthatthefermentation is the function of the internalenzymes in tea.finally,it was confirmed thatthis process is mainly completed by polyphenoloxidase.owing to its special position in tea processing,polyphenol oxidase .owing to its opecial position in tea processing,polyphenol oxidase has been uninterruptedly studied in teasphere since the end of 18 century and theresearch ckntent has been greatly enlarged anddeepened.this paper tried to summarixe theresearch achievements on tea polyphenol oxidase in past one century
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四、80年代以來的進展
80年代以來對茶葉多酚氧化酶的研究依然興趣不減，1980年前蘇聯學者лруцлзе гн在早期探索的基礎上進一步提出萎凋時ppo分子形態(tài)可能發(fā)生了變化，ppo可以有高分子態(tài)和低分子態(tài)兩種，萎凋時多酚酶可能發(fā)生低分子態(tài)向高分子態(tài)轉化，使總酶活提高［３１，７
３］。1981年ullahma提出萎凋時酶活因失水而下降，用適當的方法復水可使酶活得到一定程度恢復58，59］，1986年蕭偉祥指出，近期的研究中關于萎凋時ppo活性變化趨勢出現了兩種完全相反的結論，他認為這是酶提取方法不同所致。丙酮粉法測出的是總酶活，而勻槳法測出的是可溶性的活性。萎凋時可溶性酶活性下降，而總酶活上升［53］。1988年劉仲華研究表明，用丙酮粉法提取酶浸提與不浸提相比酶活有很大不同，浸提12小時酶提取液活力幾乎提高一倍［65,66］。實際上早先roberts已經觀察到類似結果［16］。1986年蕭偉祥對紅茶中殘留酶作了詳細研究，發(fā)現ppo在成品茶中仍有一定活性(31，32)。1981年dixma用葡萄糖凝膠測定了pod和ppo的分子量，以藍色糊精等進行校正，01nkcl檸檬酸洗脫，ppo在12vc有一弱肩峰，分子量142000，另一峰在139vc，分子量71000，證明ppo具有高分子態(tài)和低分子態(tài)兩種狀態(tài)。以后有人用高速離心法測定出ppo分子量，如以u(偏微分比容)07-078計算，ppo分子在128000-160000之間，即144000±160000［31］。80年代以來多酚氧化酶同工酶研究受到進一步重視。茶的多酚氧化酶同工酶研究始于60年代中期，1965-1966年竹尾用淀粉凝膠把ppo分成3個組分［45］，1966年ｇｒｅｇｏｒｙ用ｇ１５０也得到3條同工酶。1981年劉維華用聚丙烯酰胺凝膠電泳［62］，1983年安徽農學院茶葉系用圓盤電泳［31］分別從萎凋葉中獲得了5條同工酶。1988年葉慶生研究發(fā)現萎凋中總酶活下降，而且所得6條同工酶活性也呈下降趨勢(65)。1988年胡振長研究了殺青過程中多酚氧化酶同工酶的變化，發(fā)現殺青后仍存在1-2條同工酶［67］，1989年劉仲華研究了紅茶制造過程中多酚氧化酶同工酶的動態(tài)，證實萎凋中有新的同工酶產生［65］。
1990年施兆鵬研究了黑茶制造過程中多酚氧化酶的變化，結果表明殺青后同工酶由6條減為2條，至渥堆開始時這兩條同工酶也消失，渥堆12小時有新的同工酶出現，作者認為這是微生物分泌出多酚氧化酶的結果［69］。
1988年屠幼英測定了多酚氧化酶同工酶的等電點［70］，1991年又測定了各同工酶分子量74］。1990年譚振初［71］,劉仲華［69］各自獨立地證明檸檬酸可促使多酚氧化酶活化。稍早一些時候ｔｏｃｋｌａｉ試驗站ｃｈｏｕｇｈｕｒｒｙ ｍ．提出果膠質和果膠酶能抑制ppo活性(51)。
1990年屠幼英、吳小崇證實萎凋時可溶性ppo活性下降，而ppo總酶活性上升，但這種變化與失水無關，萎凋中確有新的同工酶出現，已糖激酶能夠促進萎凋葉多酚氧化酶活性的提高而抑制鮮葉多酚氧化酶的活性［72］。1991年屠幼英總結了ppo抑制劑的類型，有硼砂、酚類、亞硫酸鈉、vc、半胱胺酸、二乙基二硫代硫酸鈉等［70］。80年代以來多酚氧化酶同工酶在茶樹育種和生理上的應用取得顯著進展。前蘇聯學者曾提出ppo活力和ppo酶蛋白含量可作為發(fā)酵力的指標［76］，我國學者龔景文、陳興琰(1988)研究了若干茶樹品種pod、ppo以及酯酶同工酶的差異，認為同工酶可作為品種分類的依據［77］。浙江農業(yè)大學茶學系(1988)建立了同工酶數據處理方法（76）。黃惠華(1991)研究了ppo的等電點，發(fā)現葉與花的同工酶等電點基本無異，可以視為遺傳特征［76］。
1983年鳥屋尾忠之等人研究了ppo與茶樹遺傳的關系，認為ppo至少受兩組基因的控制，作者估算了ppo廣義遺傳力和狹義遺傳力的大?。?9］。
1987年楊躍華研究了同工酶變化與茶抗逆的關系，認為逆境下茶樹各酶系統包括ppo都有新的同工酶產生［79］，唐繼平(1987)［81］，stephensn/(1990)［88］研究了雜交后代ppo遺傳的關系，指出ppo主要受優(yōu)勢親本的左右。
1992年singhhp研究了花器中多酚氧化酶的變異，結果表明整個花期中ppo在花器中的分布及同工酶特征都保持穩(wěn)定，因此花器中ppo的特征可作為選種的依據［89］。
1993年王利琴用圓盤電泳分析了ppo同工酶與遺傳的關系［82］。新近奚彪等提出用基因工程方法改變茶樹體內ppo存在狀態(tài)的設想［95］。
雖然已可以肯定紅茶的變色過程中微生物不起主要作用，但微的可能作用仍不應忽視。
1973年富金原考由綠茶分離出兩種產ppo菌株，枝孢霉(ａｌｔｅｒｎａｒｌｌａ?。簦澹睿睿椋?和鏈孢霉（ｃｌａｄｏｓｐｏｓｉｕｍ?。悖郏福罚莳K聯學者也分離到兩株高產菌：ｍａｃｅｉｌｉａｉｒ，ｃｏｒｉｏｕｌｏｕｓ?。瑁椋颍螅酰簦酰?3，86］
。1987年加藤和岡本順子研究了微生物ppo用于茶發(fā)酵的可行性［84］
。1992年印度學者從茶樹葉片中分離出具有較高ppo的活性的7株真菌和3株細菌，并認為細菌更有前途［95］。1990年施兆鵬在研究黑茶渥堆中的ppo活性變化時也曾推測微生物在渥堆葉中分泌了多酚氧化酶［69］，所有這些研究為微生物在茶葉制造中的作用提供了新見解。
1983年李名君［86］，1985年ｊｅｎｉｓｈ?。悖?0］分別對茶葉中已知的酶系作了全面綜述，1988年曾洪濤、劉仲華、李遠志、張?zhí)煤愀髯詮牟煌嵌扔懻摿瞬枞~加工中多酚氧化酶的應用問題［84，85，86］，劉乾剛對多酚氧化酶定位問題作了總結［94］。1992年obenda從植物生理角度討論了茶的多酚氧化酶ｃａｔｃｈｏｌｏｘｄｓｓｅ區(qū)別于tｙｒｏｓｉｎａｄｅ(酪氨酸氧化酶)，ｌａｃｃａｓｅ(漆酶)的獨特性質［89］。1993年曾曉雄，1996年李榮林對茶葉加工中酶的利用現狀和前景作了展望，側重介紹了單寧酶和多酚氧化酶研究和利用中存在的問題［93，95］。
在茶葉加工中單寧酶的應用早已成功，并已應用了固定化酶，受此啟發(fā)1981年ｐｒａｂｈａｔ．研究了芒果和茶葉多酚氧化酶的固定化［90］。1992年前蘇聯學者ｃｈｉｎｄｉｌｉｓ?。幔芯苛硕喾友趸该鸽姌O的制作技術及酶電極法測定兒茶素的方法［91］。中國和日本學者也開展了相應研究［95］。一般認為茶的多酚氧化酶是一種鄰二酚氧化酶，但已有證據表明茶葉的氧化酶提取物確有單酚氧化酶和三元酚氧化酶的活性，可以催化對香豆酸和焦酚的氧化。這表明茶多酚氧化酶是一個復雜的體系［95］。
一個世紀以來茶多酚氧化酶研究的進展是巨大的，但仍有眾多的問題需要解決，特別是ppo的生理功能——末端氧化酶的真正地位問題至今仍缺乏明析的概念。與此相關的問題是多酚氧化酶的底物——茶多酚類物質的生理功能的研究仍相當貧乏。此外有關該酶的分子結構的研究