植物組織培養(yǎng)
一、原理
植物組織培養(yǎng)是指在無(wú)菌條件下，對(duì)離體植物組織(器官或細(xì)胞)分離并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，甚至分化發(fā)育成一完整的植株的一門(mén)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細(xì)胞的全能性，即植物體的每個(gè)細(xì)胞攜帶著一套完整的基因組，因此具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。植物組織當(dāng)中原本已經(jīng)分化的細(xì)胞，一旦脫離原有的機(jī)體環(huán)境，成為離體狀態(tài)，在適宜的營(yíng)養(yǎng)和外界條件下，就會(huì)表現(xiàn)出全能性，從已經(jīng)分化定型的細(xì)胞，脫分化，成為恢復(fù)分裂能力的細(xì)胞，并能重新生長(zhǎng)發(fā)育成完整的植株。
愈傷組織是指一個(gè)離體的細(xì)胞、一塊組織或一個(gè)器官的細(xì)胞，通過(guò)脫分化不斷分裂、增生子細(xì)胞，這些細(xì)胞胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明，逐漸形成了無(wú)序結(jié)構(gòu)的一團(tuán)細(xì)胞。
二、試劑及儀器
(一)儀器設(shè)備
超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、微波爐、人工氣候箱、電子天平、移液器(1-5ml)、恒溫磁力攪拌器、酸度計(jì)、手術(shù)刀、手術(shù)剪、稱量紙、皮筋、封口膜、三角燒瓶(500ml、100ml)、量筒、燒杯(1000ml)、試劑瓶(1000ml、100ml)、長(zhǎng)鑷子、記號(hào)筆(或標(biāo)簽紙)、培養(yǎng)皿、酒精燈、打孔器
(二)試劑
75%酒精、次氯酸鈉(或h2o2)、植物生長(zhǎng)激素、蔗糖、脂粉、hcl、naoh、kh2po4、cocl2?6h2o、煙酸、鹽酸-硫胺素(vb1)、鹽酸-吡哆醇(vb6)、肌醇、甘氨酸
三、實(shí)驗(yàn)步驟
(一)培養(yǎng)基配制
1.培養(yǎng)基的選擇
植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用的培養(yǎng)基，一般由無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、碳源、維生素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和有機(jī)附加物等五類物質(zhì)組成。
無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物包括大量元素和微量元素。大量元素：c、h、o、n、p、s、k、ca、na、mg等，微量元素：mn、zn、cu、b、mo、fe等。碳源一般為蔗糖。維生素中只有硫胺素是必需的，而煙酸、維生素b6和肌醇對(duì)生長(zhǎng)之起促進(jìn)作用。常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有iaa(吲哚乙酸)、iba(吲哚-3-丁酸)、naa(萘乙酸)、noa(萘氧乙酸)、p-cpa(對(duì)氯苯氧乙酸)、2，4-d(二氯苯氧乙酸)、2，4，5-t(三氯苯氧乙酸);bap(芐氨基嘌呤)、6-ba(芐基腺嘌呤)、2-zi(異戊烯氨基嘌呤)、kt(激動(dòng)素)等。有機(jī)附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促進(jìn)分化，但如培養(yǎng)基配方適當(dāng)，則大多數(shù)組織是不需要的。
培養(yǎng)基的種類、成份直接影響到培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)發(fā)育，故應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)植物的種類和部位，選擇適宜的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基種類繁多，最基本、最常用的培養(yǎng)基為ms培養(yǎng)基(見(jiàn)表1)。
2.培養(yǎng)基的配制
①先按表1配制ms培養(yǎng)基貯液，②再將貯液與其他成分按比例混合。③此外還需加入適量的蔗糖作為碳源，起支持作用的瓊脂粉，適量的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等。④將上述培養(yǎng)基加熱溶解后，加蒸餾水使培養(yǎng)基達(dá)到終體積。⑤再用0.1mol/lnaoh或0.1mol/lhcl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph值至最適。⑥分裝至三角燒瓶，封口膜封口，等待滅菌后使用。
3.幾種誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基
胡蘿卜ms+0.5mg/l6ba+0.5mg/lnaa
玫瑰葉盤(pán)，芽ms+0.5mg/l6ba+0.5mg/lnaa
煙草葉盤(pán)、葉柄ms+0.1mg/l6ba+0.5mg/lnaa
ph5.8，蔗糖30%，瓊脂粉6.5g/l。
(二)滅菌
1.培養(yǎng)基及器具滅菌
培養(yǎng)基、無(wú)菌水需要在高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌作用取決于溫度，常用的滅菌溫度為121℃，所需時(shí)間應(yīng)隨要滅菌的液體的容積變化而變化(見(jiàn)表2)滅菌結(jié)束后待溫度下降到50℃以下，才能取出已滅菌的培養(yǎng)基。
可用同樣方法對(duì)器具同時(shí)進(jìn)行滅菌，包括：培養(yǎng)皿、解剖刀、剪子、濾紙、鑷子、打孔器等。
2.工作環(huán)境滅菌
接種前1h打開(kāi)超凈工作臺(tái)和棚面的紫外燈照射40min。殺菌結(jié)束后，先關(guān)掉棚面的紫外燈，再打開(kāi)風(fēng)機(jī)，最后關(guān)掉超凈工作臺(tái)上的紫外燈。在接種后休息時(shí)，要先打開(kāi)臺(tái)面的紫外燈，再關(guān)風(fēng)機(jī)，最后打開(kāi)棚面紫外燈。不能將風(fēng)機(jī)與臺(tái)面上的紫外燈同時(shí)關(guān)閉或先關(guān)閉風(fēng)機(jī)再開(kāi)紫外燈。
3.植物材料的滅菌
植株各部分的表面攜帶著各種微生物，他們是植物組培的污染源，所以在接種培養(yǎng)前必須進(jìn)行徹底的表面消毒;組織內(nèi)部侵染的真菌或細(xì)菌很難消除，這些組織一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用無(wú)菌潔凈濾紙吸干水分。
文章來(lái)自:園林網(wǎng)