導(dǎo)讀
隨著藥物研發(fā)難度日益加大，分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、生產(chǎn)工藝的發(fā)展都對分析技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。比如抗體/adc 等生物制藥復(fù)雜的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性、多手性中心的對映異構(gòu)體分子分離、生物藥的連續(xù)流生產(chǎn)的在線過程分析(pat)等，這些挑戰(zhàn)都是常規(guī)一維色譜技術(shù)無法解決，或需要犧牲時間/人工成本和數(shù)據(jù)質(zhì)量。
作為色譜分析領(lǐng)域的 game changer，二維液相能否幫我們克服這些挑戰(zhàn)？二維液相能否從研發(fā)走向 qc？
本文將從 *0 制藥*：瑞士 roche(羅氏)、novartis(諾華)和美國 merck & co (默沙東)、bms(百時美施貴寶)發(fā)表的二維文獻和相關(guān)講座中，為您尋找這些問題的答案。
這些文獻和講座涉及以下應(yīng)用方向：
- 單抗多 cqa 同時分析用于細胞株篩選；在線過程分析(pat)
- 自動化單抗結(jié)構(gòu)異質(zhì)性表征-在線酶切
- adc 多 cqa 分析方法專屬性驗證
- 二維液相用于雜質(zhì)質(zhì)控可行性分析-基于 aqbd 的方法驗證
- 多手性中心對映異構(gòu)體分離
四大藥企簡介
merck 和 bms 雖然不是銷售額排名靠前美國藥企，但由于他們的 pd-1 單抗 k 藥 keytruda(merck & co)和 o 藥 opdivo(bms)，成為當下被談?wù)摱嗟膬杉移髽I(yè)。根據(jù) evaluatepharma 發(fā)布的 2021 醫(yī)藥市場展望，作為第1款 fda 批準的 pd-1 單抗，bms 的 o 藥銷售額將突破 88 億美金，而*的k藥將在2023年接棒阿達木單抗，成為新一代藥王。[1]
roche 和 novartis 總部均位于瑞士巴塞爾，2019 年處方藥銷售* 1 和第 2 名(據(jù) evaluatepharma 統(tǒng)計)，而他們的發(fā)展軌跡確截然不同[1]。novartis 起源于瑞士的汽巴、嘉基、山德士三家化工*，產(chǎn)品管線豐富。目前熱門的嵌合抗原受體t細胞免疫療法(car-t)，novartis 是擁有首fda 批準的此類療法。roche 是制藥*中生物制藥占比高公司之一， 80% 以上銷售額來自其biotech產(chǎn)品。roche 是會買的公司之一， roche 的腫瘤藥利妥昔單抗(美羅華)、曲妥珠單抗(herceptin)、貝伐株單抗 (avastin) 均出自其收購的基因泰克 (genentech)公司[2]。
大分子
merck & co：單抗多 cqa 同時分析用于細胞株快速篩選
聚集體會影響單抗的生物效價、穩(wěn)定性、安全性，因此聚集體分析是單抗生產(chǎn)工藝開發(fā)中常見的分析?？焖俚摹o需前處理的分析方法將提高細胞株篩選、工藝優(yōu)化的效率。
merck & co.與 agilent thought leader (安捷倫思想獎) 獲得者 dwight r. stoll 教授合作，基于 agilent infinitylab 2d-lc 的 asm-mhc 模式(主動溶解調(diào)制多中心切割二維液相)開發(fā)了快速 protein-a x sec 二維方法，分析已收獲的細胞培養(yǎng)液(harvested cell culture fluid samples)中目標單抗的滴度和聚集體；分析時間僅需5分鐘。系統(tǒng)考察了方法的回收率、分離度、準確度、精密度，證明快速 protein-a x sec 二維方法是一個高效的、高通量的篩選工具。[3]
圖 1. 測定 hccf 中單抗聚集體含量的工作流程?？焖?protein-a x sec 二維液相法無需手動 pap 分離工作[3]
bms：二維液相進行抗體生產(chǎn)在線過程分析(pat)
在線過程分析(pat)通過及時測量影響關(guān)鍵質(zhì)量屬性(cqa)的關(guān)鍵過程參數(shù)(cpp)來設(shè)計、分析和控制生產(chǎn)過程。pat 可以增強對工藝和產(chǎn)品的理解，以確定設(shè)計空間，尤其是在連續(xù)流工藝中意義更加重大。pat 有助于提高產(chǎn)品質(zhì)量、批次間重復(fù)性、效率和靈活性，大化節(jié)約制造空間，優(yōu)化工藝過程和穩(wěn)定性，節(jié)約資本投入和運營成本。
對于結(jié)構(gòu)異質(zhì)性復(fù)雜的抗體類藥物，傳統(tǒng)方式進行 pro-a 凈化前處理，再進行聚集體、電荷異質(zhì)性等色譜分析，無法滿足在線、實時 pat 的需求。bms 的研究人員使用 segflow 與 agilent infinitylab 2d-lc 聯(lián)用技術(shù)，實時在線分析生物反應(yīng)器培養(yǎng)基氨基酸、單抗和融合蛋白類藥物的滴度和關(guān)鍵質(zhì)量屬性，實現(xiàn)細胞培養(yǎng)過程的代謝平衡和調(diào)控。
圖 2. agilent 與 lcgc 邀請 bms 專家舉辦的關(guān)于二維液相進行抗體生產(chǎn)在線過程分析(pat)的講座
roche：自動化單抗結(jié)構(gòu)異質(zhì)性表征-在線酶切
通常 mab 分子量大約 150kd，iec 分析電荷異質(zhì)性時，如果直接完整蛋白除鹽進入高分辨質(zhì)譜，往往只能看到質(zhì)量數(shù)變化比較大的異質(zhì)性，但是對于質(zhì)量數(shù)變化很小的變異(比如脫氨，分子量變化只有 1da )，完整蛋白水平很難準確分析判斷。
roche 研發(fā)人員基于安捷倫液相模塊搭建的“四維”系統(tǒng)(4d hplc/ms)，可以對離子交換電荷異質(zhì)體進行在線酶切肽圖分析，能夠清晰的看到脫氨基、氧化等 ptm 帶來的電荷酸堿變異。[4]
4d hplc/ms 在線除鹽酶切系統(tǒng)：一維 iec 分離 mab 電荷異質(zhì)體；二維反相捕獲、還原；三維在線胰酶酶切；四維 peptide mapping 進入 ms 分析。
圖 3. 4d lc/ms工作流程簡圖[4]
novartis – adc 多 cqa 分析方法專屬性驗證
抗體偶聯(lián)藥物 adc 發(fā)展至今，已經(jīng)歷了三代，近年來廣受關(guān)注，2017-2020 共 8 個產(chǎn)品獲批。adc 藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 cqa 包括：高分子量組分 hmws，藥物抗體偶聯(lián)比 dar，載藥量分布，未偶聯(lián)小分子藥、連接子、連接子-小分子藥含量等。
novartis 研究人員開發(fā)了梯度 sec 方法用于分離 adc、高分子量組分 hmws、未偶聯(lián)小分子藥、連接子、連接子-小分子藥。并使用 agilent infinitylab 2d-lc 的 mhc 模式(多中心切割二維)進行了方法專屬性驗證，證明他們開發(fā)的梯度 sec 方法的分離效果；同時研究了梯度 sec 方法和 sec x rplc 方法的精密度和回收率；兩者精密度均在 0.01%-3.68% 之間，回收率在 82%-107% 之間。[5]
圖 4. adc 藥物的 sec x rplc 二維定量分析[5]
小分子
merck & co -小分子：多手性中心對映異構(gòu)體分離
結(jié)構(gòu)高度相似化合物的分離分析是現(xiàn)代藥物的大挑戰(zhàn)之一，比如對映異構(gòu)體的分析。新開發(fā)的小分子藥物絕大多數(shù)含有手性中心，而且多手性中心藥物的開發(fā)也已成為一個新的趨勢。多手性中心對映異構(gòu)體，幾乎不可能通過一根單一分離機制的色譜柱實現(xiàn)所有異構(gòu)體的分離。
merck & co 研究人員使用 agilent infinitylab 2dlc 的 mhc 模式(多中心切割二維)研究單手性中心藥物法華林和代謝產(chǎn)物羥基法華林的分離，使用反相x手性色譜柱的模式，在第1維實現(xiàn)原型和代謝產(chǎn)物的分離，第二維實現(xiàn)手性分離。使用 agilent infinitylab 2d-lc 的 comprehensive 2d-lc 模式(全二維)，采用手性 x 手性色譜柱的模式，實現(xiàn)了多中心藥物合成過程中異構(gòu)體的分析。研究工作作為封面文章，發(fā)表在 analytical chemistry 雜志上。[6]
圖5. merck & co 使用 agilent infinitylab 2d-lc 在 analytical chemistry 上發(fā)表的封面文章[6]
genentech：二維液相用于 qc 的可行性
二維液相在分離上的優(yōu)勢有目共睹，但這種技術(shù)是否足夠穩(wěn)定，是否可以應(yīng)用于 gmp 環(huán)境下的 qc 分析呢？
genentech 使用安捷倫單中心切割二維液相，基于 qbd 理念，通過 doe(實驗設(shè)計)考察了關(guān)鍵方法參數(shù) cmps(中心切割的關(guān)鍵因素：進入 2d 的餾分組成(ph、有機相比例) 及 loop 環(huán)的填充比例)的設(shè)計空間 modr 和操作空間 par，對關(guān)鍵方法屬性 cmas 進行驗證，以證明二維在 gmp 環(huán)境中的質(zhì)控可行性。[7]
圖 6. 通過 qbd 軟件進行二維分離三大關(guān)鍵變量設(shè)計空間的確認[7]
安捷倫二維液相方案，改變你的色譜分析
以上案例詮釋了安捷倫二維液相方案在解決不確定性問題、復(fù)雜樣品的完整信息、和復(fù)雜處理自動化等方面的優(yōu)勢。
安捷倫自 2012 年推出市場第1款商品化二維液相產(chǎn)品以來，一直在該領(lǐng)域持續(xù)創(chuàng)新。產(chǎn)品也被世界 top 藥企廣泛認可，并應(yīng)用于藥物研發(fā)工作。
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參考文獻：
[1] 2021醫(yī)藥市場展望
[2] fiona yu. 制藥巨擘的成功密碼——小故事，大策略，為你解讀跨國藥企背后的秘密. 藥時代. 2020.
[3] zachary d. dunn, jayesh desai, gabriel m. leme, dwight r. stoll, and douglas d. richardson. rapidtwo-dimensional protein-a size exclusion chromatography of monoclonal antibodies for titer and aggregation measurements from harvested cell culture fluid samples. mabs (taylor & francis online), volume 12, 2020 -issue 1
[4] gsto?ttner, c.; klemm, d.; haberger, m.; bathke, a.; wegele, h.;bell, c.; kopf, r.fast and automated characterization of antibody variants with 4d hplc/ms, anal. chem.2018, 90, 3, 2119–212
[5] alexandre goyon, luca sciascera, adrian clarke, davy guillarme, reinhard pell. extending the limits of size exclusion chromatography: simultaneous separation of free payloads and related species from antibody drug conjugates and their aggregates. journal of chromatography a, 1539 (2018) 19–29
[6] chandan l. barhate, erik l. regalado,nathan d. contrella,joon lee,junyong jo,alexey a. makarov, daniel w. armstrong,andchristopher j. welch. ultrafast chiral chromatography as the second dimension in two-dimensional liquid chromatography experiments. anal. chem. 2017, 89, 3545−3553
[7] samuel h. yang, jenny wang, kelly zhang. validation of a two-dimensional liquid chromatography method for quality control testing of pharmaceutical materials. j. chromatogr. a 1492 (2017) 89–97
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