中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
ny/t 3290-2018
水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的測(cè)定
液質(zhì)聯(lián)用法
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于水果、蔬菜及其制品中14種主要酚酸的含量測(cè)定。
本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限和定量限見(jiàn)附錄a。
2規(guī)范性引用文件
下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不ke少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
gb/t 8855新鮮水果和蔬菜取樣方法
3原理
水果、蔬菜及其制品中的酚酸經(jīng)甲醇提取和堿性水解液提取處理得到游離型酚酸、游離酯型酚酸和結(jié)合型酚酸，經(jīng)固相萃取小柱凈化，超高效液相色譜柱分離，三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)，外標(biāo)法定量。
4試劑和材料
除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水
4.1試劑
4.1.1鹽酸（hcl）：優(yōu)級(jí)純。
4.1.2甲酸（hcooh）：色譜純。
4.1.3甲醇（ch3oh）：色譜純。
4.1.4乙腈（ch3cn）：色譜純。
4.1.5氫氧化鈉（naoh）：優(yōu)級(jí)純。
4.1.6提取劑：甲醇+水+鹽酸= 80+20+0.05（v+v+v），取800 ml甲醇（4.1.3）、200 ml水和
0.5 ml鹽酸（4.1.1），混勻。
4.1.7 4mol/l氫氧化鈉溶液：稱取160.0g氫氧化鈉（4.1. 5），用水溶解定容至1000 ml。
4.2標(biāo)準(zhǔn)品
14種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，相關(guān)信息見(jiàn)附錄a。
4.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
4.3.1酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取酚酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg，用甲醇（4.1.3）溶解并定容至10ml，配制成1mg/ml的各酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20℃保存，可使用12個(gè)月。
4.3.2酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：根據(jù)需要，準(zhǔn)確吸取一定量的各酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇（4.1. 3）稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
4.4材料
4.4.1有機(jī)相微孔濾膜：0. 22μm。
4.4.2固相萃取小柱：oasis hlb固相萃取小柱，200 mg，6 ml，或性能相當(dāng)者。
5儀器
5.1液相色譜儀：配有三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器。
5.2電子天平：感量為0.01g和0. 0001g。
5.3離心機(jī)：可達(dá)到9000r/min以上。
5.4振蕩器：帶有溫度控制。
5.5超聲波清洗器。
5.6旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：帶有溫度控制。
6試樣的制備
水果、蔬菜及其固體制品按gb/t 8855的規(guī)定取樣，四分法取約250 g，將可食部分切碎，立即用液氮冷凍，研磨成粉末，備用。液體果蔬制品直接混勻備用。
7分析步驟
7.1提取
稱取10.00 g試樣于50 ml棕色離心管中，加入30 ml提取劑（4.1.6），混勻，室溫下超聲20 min，9000 r/ min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入50 ml棕色容量瓶中，殘?jiān)儆眉s10 ml提取劑（4.1.6）按上述步驟重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，用提取劑（4.1. 6）定容至50 ml用于游離型酚酸和游離酯型酚酸的制備，殘?jiān)糜诮Y(jié)合型酚酸的制備。
7.2酚酸的制備
7.2.1游離型酚酸的制備
吸取10.00ml樣品提取液（7.1）于100ml旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，40℃下減壓蒸發(fā)除去提取液中的有機(jī)溶劑，濃縮至近干，加入2 ml水，播勻，備用，即為溶液a。將固相萃取小柱（4.4.2）依次用約5 ml甲醇（4.1. 3）和約5 ml水預(yù)淋洗、活化，將溶液a加到固相萃取小柱中，緩慢抽濾，濾液需呈滴狀，棄去濾液，用2ml水清洗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，轉(zhuǎn)入固相萃取小柱中，抽濾，棄去濾液，用約5ml甲醇（4.1.3）分兩次，清洗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，加入到固相萃取小柱中，收集濾液，用甲醇（4.1. 3）定容至5 ml，混勻，過(guò)濾膜（4.4.1）待測(cè)。
7.2.2游離酯型酚酸的制備
吸取10.00ml樣品提取液（7.1）于100ml旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，40℃下減壓蒸發(fā)除去提取液中的有機(jī)溶劑，濃縮至近干，用10 ml 4mol/l氫氧化鈉溶液（4.1. 7）分三次清洗旋蒸瓶，清洗液合并到50 ml棕色離心管，40℃避光振蕩水解2 h，用鹽酸（4.1. 1）調(diào)節(jié)ph至2，混勻，備用，即為溶液b。將固相萃取小柱（4.4.2）依次用約5ml甲醇（4.1.3）和約5ml水預(yù)淋洗、活化，將溶液b加到固相萃取小柱中，抽濾，棄去濾液，用約5ml甲醇（4.1.3）分兩次清洗離心管，加入到固相萃取小柱中，收集濾液，用甲醇（4.1. 3）定容至5 ml，混勻，過(guò)濾膜（4.4. 1）待測(cè)。
7.2.3結(jié)合酯型酚酸的制備
殘?jiān)?.1）用30 ml提取劑（4.1. 6）分兩次清洗后，用20 ml 4mol/l氫氧化鈉溶液（4.1. 7）清洗到50 ml棕色離心管中，40℃避光振蕩水解2 h，離心吸取10 ml，用鹽酸（4.1.1）調(diào)節(jié)ph至2為溶液c。將固相萃取小柱（4.4.2）依次用約5 ml甲醇（4.1. 3）和約5 ml水預(yù)淋洗、活化，將溶液c加至固相萃取小柱中，抽濾，棄去濾液，用約5 ml甲醇（4.1. 3）分2次清洗固相萃取小柱，加入到固相萃取小柱中，收集濾液，用甲醇（4.1.3）定容至5 ml，混勻，過(guò)濾膜（4.4. 1）待測(cè)。
7.3試劑空白試驗(yàn)
除不加入樣品外，其他過(guò)程與樣品處理相同。
7.4測(cè)定
7.4.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參考條件
色譜柱waters hss t3色譜柱，柱長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑2.1 mm，顆粒度1.8μm，連接同款保護(hù)柱或性能類似的色譜柱。
流速：0.3 ml/ min。
流動(dòng)相：a相為0. 1%甲酸，b相為乙腈（含0. 1%甲酸），流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。
表1流動(dòng)相梯度洗脫程序
時(shí)間min
流動(dòng)相a
流動(dòng)性b
0.00
95
5
0.50
95
5
5.00
70
30
9.5
10
90
10
95
5
15
95
5
柱溫：40℃。
進(jìn)樣量：5μl。
電離源模式：電噴霧離子化。
電離源極性：負(fù)離子模式和正離子模式。
霧化氣：氮?dú)狻?br>碰撞氣（高純氬氣）流速：0.13 ml/min。
離子源溫度：150℃。
脫溶劑氣溫度：500℃。
脫溶劑氣流量：800 l/h。
監(jiān)測(cè)離子對(duì)碰撞氣能量和源內(nèi)破碎電壓參見(jiàn)附錄b。
7.4.2定性測(cè)定
在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)樣品檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品相一致，并且扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選離子均出現(xiàn)，且所選的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子豐度比相一致（表2），則可判斷為該成分。試劑空白（7.3）同樣進(jìn)樣測(cè)定。試劑空白不能檢出有對(duì)被測(cè)組分有干擾的物質(zhì)。各目標(biāo)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（mrm）色譜圖參見(jiàn)附錄c。
表2質(zhì)譜選擇離子豐度允許偏差
單位為百分率
相對(duì)豐度
＞50
＞20~50
＞10~20
≤10
允許偏差
≤±20
≤±25
≤±30
≤±50
7.4.3定量測(cè)定
標(biāo)準(zhǔn)采用外標(biāo)-校準(zhǔn)曲線法定量測(cè)定。保證所測(cè)樣品中組分的響應(yīng)值均在儀器的線性范圍內(nèi)。
8結(jié)果計(jì)算
樣品中待測(cè)組分的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，以毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/l）表示，按式（1）計(jì)算。
式中：
x——試樣中待測(cè)組分的含量，單位為毫克每千克（mg/ kg）或毫克每升（mg/l）；
ρ——標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣提取溶液中各組分的濃度，單位為毫克每升（mg/l）；
v——試樣提取液定容體積，單位為毫升（ml）；
m——所取試樣的量，單位為克（g）或毫升（ml）；
計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后兩位。
9精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的12%。
在再現(xiàn)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%。