（1）引物及濃度：①長度：15～30bp。②堿基：g+c含量以40%～60%為宜，atgc最好隨機分布，避免5個以上的堿基成串排列。③避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)、兩條引物間互補，特別是3′端的互補。④引物3′端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對。⑤與其它序列無明顯同源性。⑥濃度為0.1～1μmol或10～100pmol。（2）酶及其濃度：催化一典型的pcr反應(yīng)約需酶量2.5u（指總反應(yīng)體積為100μl時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。（3）dntp的質(zhì)量與濃度：dntp應(yīng)為50～200μmol/l，4種dntp的濃度要相等（等摩爾配制），過高dntp能與mg2+結(jié)合，使游離的mg2+濃度降低。（4）模板：模板的量與純化程度，是pcr成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，避免dna純化中的sds和蛋白酶k等雜質(zhì)。（5）mg2+濃度：一般的pcr反應(yīng)中，各種dntp濃度為200μmol/l時，mg2+濃度為1.5～2.0mmol/l為宜。mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低taq dna聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。（6）溫度與時間：①變性：93℃～94lmin℃，過高或過低的溫度影響酶的活性。②退火：取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。一般高于tm值5℃～10℃，時間為30～60s。③延伸：常用溫度為72℃，時間根據(jù)待擴增片段的長度而定。（7）循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板dna的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。