嵌合抗原受體（car）t細(xì)胞治療是適應(yīng)性免疫治療的前沿。car-t細(xì)胞是由t細(xì)胞設(shè)計而來的，通過促進癌細(xì)胞表面的相互作用來特異性地靶向腫瘤細(xì)胞。car-t細(xì)胞的激活導(dǎo)致了由car-t細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生的細(xì)胞信號通路的增加，以破壞靶向腫瘤細(xì)胞。這篇綜述旨在展示使用不同類型的檢測方法來檢測car-t或t細(xì)胞活化和殺傷靶腫瘤細(xì)胞的效果。
cd19特異性car-t治療，kymriah®和yescarta®分別治療急性淋巴細(xì)胞白血病（all）和非霍奇金淋巴瘤，為臨床中具有更多car-t靶點的其他car-t治療打開了大門。到目前為止，主要成功的藥物是靶向血液惡性腫瘤。它比實體腫瘤更容易靶向，而實體腫瘤由于免疫抑制微環(huán)境而具有更高的屏障（wang et al.）。
car-t設(shè)計包括一個抗原結(jié)合位點、鉸鏈和間隔區(qū)，以及細(xì)胞內(nèi)激活域。第一代表達一個t細(xì)胞內(nèi)激活信號域（cd3ζ），而第三代現(xiàn)在通常表達共刺激域（cd28，或4-1bb）（androulla和lefkothea）。
一、car-t細(xì)胞活化
當(dāng)car-t細(xì)胞識別腫瘤抗原并與腫瘤細(xì)胞結(jié)合時，細(xì)胞因子、穿孔素和顆粒酶的釋放，會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞和周圍間質(zhì)中的細(xì)胞死亡（benmebrarek et al.）。這些細(xì)胞因子可包括ifnγ、tnfα、il-2和il-8。在模擬car-t治療的共培養(yǎng)體外模型系統(tǒng)中，可以在細(xì)胞上清液檢測到。
von scheidt等使用alphalisa檢測了在存在雙特異性cmyc/cd40抗體的共培養(yǎng)環(huán)境下，car-t細(xì)胞產(chǎn)生的ifnγ。cmyc標(biāo)簽僅存在于car-t細(xì)胞中，cd40在抗原提呈細(xì)胞（apcs）上表達，包括樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和b細(xì)胞的亞群。在cd40+apcs通過流式細(xì)胞術(shù)和ifnγ釋放來檢測car-t細(xì)胞增殖，其對照組為未轉(zhuǎn)導(dǎo)car分子的僅包含c-myc tagged anti-her2。
copyright: von scheidt, b. et al. enterotoxins can support car t cells against solid tumors. pnas 116:50 (2019). figure reproduced with permissions granted by pnas.
二、car-t殺傷功能檢測
除了使用細(xì)胞因子的釋放來測量car-t細(xì)胞的活性外，對靶向腫瘤細(xì)胞群中特異性細(xì)胞裂解的檢測也顯示了car-t細(xì)胞的殺傷活性。delfia eutda細(xì)胞毒性試劑安全、快速的用batda試劑標(biāo)記靶細(xì)胞，一旦進入細(xì)胞，內(nèi)酯酶裂解batda底物形成tda，不能再穿過細(xì)胞膜屏障。標(biāo)記靶細(xì)胞的裂解釋放上清液中的tda，然后將其轉(zhuǎn)移到檢測板上，并與銪溶液結(jié)合生成熒光分子eutda。信號與靶細(xì)胞的死亡呈現(xiàn)正相關(guān)。
du s-h等使用delfia eutda細(xì)胞毒性試劑、raji和daudi細(xì)胞，比較了多種抗cd19 car分子的car-t細(xì)胞的殺傷功能。如下圖，相對于對照組mock和gfp car-ts，幾乎所有car分子均使得殺傷率顯著增加。證明了將car-t添加到t細(xì)胞亞群和提高細(xì)胞殺傷能力是有效的。
copyright: du s-h, li z, chen c, tan w-k, chi z, kwang tw, et al. (2016) co-expansion of cytokine-induced killer cells and vγ9vδ2 t cells for car t cell therapy. plos one 11(9): e0161820.
三、聯(lián)合免疫療法
免疫療法的另一種策略是尋找能增強t細(xì)胞活性的小分子或生物制劑。靶向ctla4或pd1途徑的檢查點抑制劑分子。檢查點抑制劑靶向t細(xì)胞上的抑制性受體，重新激活抗腫瘤免疫反應(yīng)（havel et al.）。
dextaras等依據(jù)上述思路篩選小分子，通過檢測t細(xì)胞活化的標(biāo)志物-ifnγ，使用htrf技術(shù)來篩選可以促使ifnγ分泌增加的小分子。
dexesas等人篩選了大約500種小分子。研究發(fā)現(xiàn)36個活性分子增加了ifnγ的分泌。這些結(jié)果通過正交分析，如細(xì)胞增殖，并通過qrt-pcr，最終得到4種化合物，認(rèn)為可針對braf突變黑色素瘤患者進行下一步研究。
copyright: dextras, c. et al. (2020). identification of small molecule enhancers of immunotherapy for melanoma. scientific reports. 10:5688
體外car-t或t細(xì)胞的活化可以使用alphalisa和htrf等均相檢測技術(shù)檢測ifnγ來評估。方法簡單，靈敏，穩(wěn)定，以最少的樣本消耗最快的獲得結(jié)果。此外，共培養(yǎng)實驗中的靶細(xì)胞死亡可以使用delfia eutda細(xì)胞毒性試劑來檢測。穩(wěn)定的熒光替代更傳統(tǒng)的cr51釋放檢測。
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參考文獻
1.wang, z. et al. (2017). current status and perspectives of chimeric antigen receptor modified t cells for cancer treatment. protein cell, 8:896-925
2.androulla and lefkothea (2018). car t-cell therapy: a new era in cancer immunotherapy. current pharmaceutical biotechnology, 19 p5-18
3.benmebarek, m. et al. (2019). killing mechanisms of chimeric antigen receptor (car) t cells. international journal of molecular sciences, 20:1283
4.von scheidt, b. et al. (2019) enterotoxins can support car t cells against solid tumors. pnas 116:50.
5.du s-h, li z, chen c, tan w-k, chi z, kwang tw, et al. (2016) co-expansion of cytokine-induced killer cells and vγ9vδ2 t cells for car t cell therapy. plos one 11(9):
e0161820.
6.havel, j. et al. (2019) the evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy. nat rev cancer 19(3): 133–150
7.dextras, c. et al. (2020). identification of small molecule enhancers of immunotherapy for melanoma. scientific reports. 10:5688
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