一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察
１、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解**在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。２、**細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的**在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。，以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。１）**的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。（圖３－８） 圖３－８ **的培養(yǎng)特征1.點(diǎn)狀 2.圓形 3.絲狀 4.不規(guī)則形 5.假根狀 6.紡錘狀 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.墊狀 11.臍狀 12.邊緣整齊 13.波狀 14.裂片狀 15.嚙蝕狀 16.絲狀 17.卷發(fā)狀 18.絲線狀 19.刺毛狀 20.串珠狀 21.疏展?fàn)?22.樹根狀 23.假根狀 24.絲狀 25.串珠狀 26.**狀 27.絨毛狀 28.樹根狀 29.量杯狀 30.蘿卜狀 31.漏斗狀 32.囊狀 33.層狀 34.絮狀 35.環(huán)狀 36.蹼狀 37.膜狀２）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和**的很相似，只是比**菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和**相似，有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。二、生理生化試驗(yàn)微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：１、糖酵解試驗(yàn)不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置36±1.0°c培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無動(dòng)力，若有動(dòng)力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。本試驗(yàn)主要是檢查**對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種**的鑒別，因而每次試驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和an-drade指示劑。２、淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承?*可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。試驗(yàn)方法：以18~24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種，試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1°c培養(yǎng)24~48h，或于20°培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生*的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和ph等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基ph必須為中性或微酸性，以ph7.2*適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。３、v-p試驗(yàn)?zāi)承?*在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱v－p（+）反應(yīng)。試驗(yàn)方法：１）o’meara氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°c培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液1ml加o’meara試劑（加有0.3%肌酸creatine或肌酸酐creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動(dòng)試管1~2min，靜置于室溫或36±1°c恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張?jiān)?8~50°c水浴放置2h后判定結(jié)果者。２）barritt氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°c培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°cα萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動(dòng)2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°c恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。３）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它**時(shí)，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。４、甲基紅（methyl red）試驗(yàn) 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基ph值下降至ph4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。試驗(yàn)方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于36±1°c或30°c（以30°c較好）3~5天，從**天起，每日取培養(yǎng)液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑，ph范圍為4.4~6.0，其pk值為5.0。故在ph5.0以下，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在ph5.0以上，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在ph5.0或上下接近時(shí)，可能變色不夠明顯，此時(shí)應(yīng)延長培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)。５、靛基質(zhì)（imdole）試驗(yàn)?zāi)承?*能分解蛋白胨中的*，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36±1c培養(yǎng)24h時(shí)后，取約2ml培養(yǎng)液，加入kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng)，若先用二甲苯或等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。６、硝酸鹽（nitrate）還原試驗(yàn)有些**具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾?。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：臨試前將試劑的a（磺胺酸冰醋酸溶液）和b（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。用α-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。７、明膠（gelatin）液化試驗(yàn)有些**具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。試驗(yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被**液化，如確被液化，即為試驗(yàn)陽性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽性，10~20min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。８、尿素酶（urease）試驗(yàn)有些**能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖冢?*均能合成此酶。其活性*適ph為7.0。試驗(yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1℃培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作*終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。９、氧化酶（oxidase）試驗(yàn)氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素c氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素c再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或*菌落上滴加試劑1~2滴，陽性者kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。10、硫化氫（h2s）試驗(yàn)有些**可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。試驗(yàn)方法：在含有*等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36±1℃培養(yǎng)24~28h，培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1℃培養(yǎng)1~6天。紙條變黑為陽性。11、三糖鐵（tsi）瓊脂試驗(yàn)試驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之**利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。12、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（sim）瓊脂試驗(yàn)試驗(yàn)方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動(dòng)力，然后加kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對照。本試驗(yàn)用于腸桿菌科**初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。三、血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的**，以*終確認(rèn)檢測結(jié)果。血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn)：1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。4)血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無嚴(yán)格界限。**階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。**階段為抗原體反應(yīng)的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長時(shí)間。而且，在**階段反應(yīng)中，電解質(zhì)、ph、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。１、凝集反應(yīng)顆粒性抗原（**、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)（agglutination reaction）。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中，因?yàn)閱挝惑w積抗體量大，做定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)稀釋抗體。１）直接凝集反應(yīng)顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng)，稱為直接凝集反應(yīng)(directagglution reaction)。a.玻片凝集法。是一種常規(guī)的定性試驗(yàn)方法。原理是用已知抗體來檢測未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數(shù)分種后若出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，即陽性反應(yīng)，證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡便，但不能進(jìn)行定量測定。b.試管凝集法。是一種定量試驗(yàn)方法。多用已知抗原來檢測血清中有無相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。如肥達(dá)氏反應(yīng)就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗(yàn)。因?yàn)橐獪y定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度，然后加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小時(shí)觀察，血清*高稀釋度仍有明顯凝集現(xiàn)象的，為該抗血清的凝集效價(jià)。２）間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與**無關(guān)的，顆粒狀微球表面，然后與相應(yīng)抗體（抗原）作用，在有電解質(zhì)存在的條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)(indirect agglutination)。由于載體增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積。當(dāng)載體上有少量抗原與抗體結(jié)合。就出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，敏感性很高。２、沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（precipitation）。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原，抗體為沉淀素。由于在單位體積內(nèi)抗原量大，為了不使抗原過剩，故應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。１）環(huán)狀沉淀反應(yīng)：是一種定性試驗(yàn)方法，可用已知抗體檢測未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對應(yīng)，則在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。２）絮狀沉淀反應(yīng)：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對應(yīng)，而又二者比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀，此為陽性反應(yīng)。３）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴(kuò)散，若抗原抗體對應(yīng)，且二者比例合適，在其擴(kuò)散的某一部分就會(huì)出現(xiàn)白色的沉淀線。每對抗原抗體可形成一條沉淀線。有幾對抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴(kuò)散可分為單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩種類型。單向擴(kuò)散是一種定量試驗(yàn)?？捎糜?*蛋白含量的測定。而雙向擴(kuò)散多用于定性試驗(yàn)。由于方法簡便易行，常用于測定分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分。３、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(complement fixationreaction)是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，如果與**及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，整個(gè)試驗(yàn)需要有補(bǔ)體、待檢系統(tǒng)（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指示系統(tǒng)（綿羊細(xì)胞和溶血素）五種成份參加。其試驗(yàn)原理是補(bǔ)體不單獨(dú)和抗原或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌，是補(bǔ)體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果，說明抗原抗體是相對應(yīng)的，如果出現(xiàn)溶血，說明抗原抗體不相對應(yīng)。此反應(yīng)操作復(fù)雜，敏感性高，特異性強(qiáng)，能測出少量抗原和抗體，所以應(yīng)用范圍較廣。
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