中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準
ny/t 2640-2014
植物源性食品中花青素的測定
高效液相色譜法
determination of anthocyanidins in plant origin products-
high performance liquid chromatography
1范圍
本標準規(guī)定了植物源性食品中的飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素共6種花青素的高效液相色譜測定方法。
本標準適用于植物源性食品中花青素含量的測定。
本標準的檢出限：以稱樣量為1 g，定容體積為50 ml計，飛燕草色素、矢車菊色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素5種花青素的檢出限均為0.15mg/kg；矮牽牛色素的檢出限為0.5mg/kg。同樣條件下定量限：飛燕草色素、矢車菊色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素5種花青素均為0.5mg/kg；矮牽牛色素為1.5mg/kg。
2規(guī)范性引用文件
下列文件對于本文件的應用是必不可（ke）少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
gb/t 6379.1測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第1部分：總則與定義
gb/t 6379.2測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現(xiàn)性的基本方法
gb/ t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3原理
植物源性食品中的花青素主要以花色苷的形式存在。試樣經(jīng)乙醇-水的強酸溶液超聲提取花色苷后，經(jīng)沸水浴將花色苷水解成花青素，用高效液相色譜法測定，以保留時間定性，外標法定量。
4試劑和材料
除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。水為gb/ t 6682規(guī)定的一級水。
4.1無水乙醇(c2h5oh)：色譜純。
4.2甲酸(ch2o2)：色譜純。
4.3甲醇(ch3oh)：色譜純。
4.4鹽酸(hcl)：優(yōu)級純。
4.5提取液：無水乙醇+水+鹽酸= 2+1+1(v+ v+v)，取200 ml無水乙醇、100 ml水和100 ml鹽酸混勻。
4.6 10%鹽酸甲醇溶液(體積比)：取10ml鹽酸、90ml甲醇混勻。
4.7飛燕草色素(delphinidin)：cas號528-53-0，純度≥96%。
4.8矢車菊色素(cyanidin)：cas號528-58-5，純度≥98%。
4.9矮牽牛色素(petunidin chloride)：cas號1429-30-7，純度≥96%。
4.10天竺葵色素(pelargonidin)：cas號134 -04-3，純度≥96%。
4.11芍藥素(peonidin)：cas號134-01-0，純度≥98%。
4.12錦葵色素(malvidin)：cas號643-84-5，純度≥96%.
4.13單標儲備溶液
分別準確稱取飛燕草色素(delphinidin)、矢車菊色素(cyanidin)、矮牽牛色素(petunidin chloride)、天竺葵色素(pelargonidin)、芍藥素(peonidin)和錦葵色素(malvidin)共6種花青素標準品5.0mg，用10%鹽酸甲醇溶液(4.6)溶解并分別定容至10ml容量瓶中，即為500mg/l的單標儲備液，于-18℃下，貯存于密閉的棕色玻璃瓶中，保存有效期為6個月。
4.14混合標準使用液
在使用中將單-標準儲備液進行混合后，用10%鹽酸甲醇溶液(4.6)作為溶劑，并逐級稀釋成0.5mg/l、1.0 mg/l、5.0 mg/l、25.0 mg/ l、50.0 mg/ l或其他濃度的花青素混合標準使用液。在4℃條件下，有效期為6個月。
4. 15濾膜：0.45μm，水相濾膜。
5儀器與設備
5.1高效液相色譜儀帶
紫外或二極管陣列檢測器。
5.2天平：精度0.01 mg，0.01 g。
5.3水浴鍋：精度±2℃。
5.4勻漿機。
5.5超聲波清洗機。
5.6粉碎機。
6分析步驟
6.1試樣制備
采用四分法分取樣品，含水率高的樣品，如葡萄茄子等，取約200g于勻漿機中勻漿；含水率低的樣品，如黑米、黑豆等，用粉碎機進行粉碎，過250μm的篩。所有樣品在-18℃條件下保存。
6.2提取
根據(jù)樣品中花青素含量，稱取樣品1.00g~10.00g于50 ml具塞比色管中，加入提取液(4.5)定容至刻度，搖勻1min后，超聲提取30min。
6.3水解
超聲提取后，于沸水浴中水解1 h，取出冷卻后，用提取液(4.5)再次定容。靜置，取上清液，用0.45μm水相濾膜過濾，待測。樣品制備好后，在4℃條件下，保存時間不超過3 d。
6.4測定
6.4.1色譜參考條件
a)色譜柱：c18柱，250 mm×4. 6mm×5μm或性能相當者；
b)流動相a為含1%甲酸水溶液，流動相b為含1%甲酸乙腈溶液；
c)檢測波長：530 nm；
d)柱溫：35℃；
e)進樣量：20μl；
f)梯度洗脫條件，見表1。
6.4.2色譜分析
分別將標準溶液和試樣溶液，注入液相色譜儀中，以保留時間定性，以樣品溶液峰面積與標準溶液峰面積比較定量。色譜圖參見附錄a。
7結果計算
樣品中花青素含量為6種花青素含量之和。其含量以質量分數(shù)ω計，單位為毫克每千克(mg/kg)，按式(1)計算。
式中：
ρ——待測液中各花青素的質量濃度，單位為毫克每升(mg/l)；
v——定容體積，單位為毫升(ml)；
m——試樣質量，單位為克(g)。
測定結果取兩次測定的算術平均值，計算結果保留三位有效數(shù)字。
8精密度
本標準精密度數(shù)據(jù)是按照gb/t 6379.1和gb/t6379.2的規(guī)定確定的，獲得重復性和再現(xiàn)性的值是以95%的置信度來計算。本標準方法的精密度數(shù)據(jù)參見附錄b。