單克隆抗體技術(shù)原理及基本流程:
原理:
哺乳類細(xì)胞dna合成可分為兩條途徑,①從頭(de novo)合成途徑,利用磷酸核糖焦磷酸和尿嘧啶,可被氨基蝶呤(a)阻斷;②補(bǔ)救(salvag-e)合成途徑,在次黃piaoling磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶( hgprt)存在下利用次黃piaoling(h)和胸腺嘧啶(t)。
單克隆抗體技術(shù)的流程為:脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇(peg)作用下發(fā)生細(xì)胞融合;加入hat選擇培養(yǎng)基(含h、a和t)后,未融合的骨髓瘤細(xì)胞因其從頭合成途徑被氨基蝶呤阻斷,而又缺乏hgprt不能利用補(bǔ)救途徑合成dna,從而死亡;未融合的脾細(xì)胞難以在體外培養(yǎng)而死亡;融合細(xì)胞因從脾細(xì)胞獲得hgprt,故可在hat選擇培養(yǎng)基中存活和增殖。
基本流程:
一、動(dòng)物免疫
(1) 抗原制備。
(2) 免疫動(dòng)物的選擇。
(3) 免疫程序的確定。
二、細(xì)胞融合
首先制備細(xì)胞培養(yǎng)基、 氨基喋呤(a)貯存液、次黃piaoling和胸腺嘧啶核苷(ht)貯存液等各種細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。然后制備髓瘤細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞,之后進(jìn)行細(xì)胞融合。在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中,由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡,此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活,通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖,這 種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了,一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子,為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長 條件;也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。
三、細(xì)胞篩選
雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選,即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來,通常也稱為抗體檢測(cè)??贵w檢測(cè)的方法很多,通常根據(jù)所研究的抗原和 實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測(cè)方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡(jiǎn)便,便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯€(gè)樣品需要在短短幾個(gè)小時(shí)就報(bào) 告結(jié)果,以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測(cè)方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說來,在融合之前就必須建立好抗體檢測(cè) 方法,并克服可能存在的問題。另一個(gè)重要問題是抗體檢測(cè)方法所需要的“動(dòng)力學(xué)范圍”,即檢出背景以上的最qiang與最弱信號(hào)之比,依所用的檢測(cè)抗原是否純凈而 定。如雜交瘤抗體是針對(duì)純化的蛋白質(zhì)抗原的,抗原參與反應(yīng),一個(gè)陽性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另一方面,如果雜交瘤抗體是針對(duì)細(xì)胞表面微量的蛋白 抗原,檢測(cè)系統(tǒng)可能需要能測(cè)出微弱信號(hào),則動(dòng)力學(xué)范圍至少應(yīng)為10:1,最hao為100:1。另外,檢測(cè)方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預(yù)定的用途的 影響。結(jié)合補(bǔ)體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性反應(yīng)的檢測(cè)方法來選出。如需結(jié)合a蛋白的雜交瘤抗體,就要用結(jié)合蛋白a的檢測(cè)方法。
四、克隆化
從原始孔中得到的陽性雜交瘤細(xì)胞,可能來源于二個(gè)或多個(gè)雜交瘤細(xì)胞,因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到wanquan同質(zhì)的單克隆抗體,必須對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn) 行克隆化。另一方面,雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的,有的細(xì)胞丟失部分染色體,可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞,得到分泌 抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系(又稱亞克隆),也需要克隆化。另外,長期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞,復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失,因此也應(yīng)作克隆化, 以檢測(cè)抗體分泌情況。通常在得到針對(duì)預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行2-3次克隆化,有時(shí)還需進(jìn)行多次。所謂克隆化是指使單個(gè)細(xì)胞無性繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán) 體的整個(gè)培養(yǎng)過程。克隆化的方法很多,如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類儀(facs)分離法。
五、凍存與復(fù)蘇
(1) 雜交瘤細(xì)胞的凍存。
(2)雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇。
六、鑒定單抗特性
(1) 單克隆性的確定 包括雜交瘤細(xì)胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。
(2)單抗理化特性的鑒定。從實(shí)用意義上說,單抗對(duì)溫度和ph變化的敏感性以及單抗的親合力都是理化特性鑒定的主要項(xiàng)目,它們可為單抗的使用和保存提供重要依據(jù)。
(3)單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性測(cè)定。單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性決定于它所識(shí)別的抗原表位,確定單抗針對(duì)的表位在抗原結(jié)構(gòu)上的位置,是單抗特性鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié),同時(shí),進(jìn)一步分析這類表位的差別, 可正確評(píng)價(jià)單抗的特異性和交叉反應(yīng)性。
單克隆抗體定制服務(wù)推薦——義翹神州:
針對(duì)定制單克隆抗體,義翹神州提供了一套全面的解決方案。我們將與您通力合作,完成從抗原設(shè)計(jì)、純化和抗體驗(yàn)證的完整過程。義翹神州擁有包括雜交瘤、噬菌體抗體庫和單b細(xì)胞在內(nèi)的抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái), 我們可根據(jù)您感興趣的靶點(diǎn)、抗體應(yīng)用和時(shí)間表等,來選擇最合適的技術(shù)平臺(tái)。 此外,義翹神州還提供elisa、wb、流式細(xì)胞術(shù)、ihc、基于細(xì)胞的篩選、親和力檢測(cè)等多種表征和篩選技術(shù),確保最終鑒定到最jia的抗體,以滿足研究、診斷和治療領(lǐng)域等應(yīng)用。
cn.sinobiological com/services/monoclonal-antibody-production-services