上海銘博生物實(shí)驗(yàn)室介紹：細(xì)胞免疫治療的監(jiān)控細(xì)胞樣本制備開(kāi)始
一次完整的流式細(xì)胞分析包括：細(xì)胞樣本制備，流式細(xì)胞儀操作和數(shù)據(jù)分析。細(xì)胞樣品制備在流式分析過(guò)程中的重要性毋庸置疑，直接影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度及實(shí)驗(yàn)的整體進(jìn)展。然而傳統(tǒng)細(xì)胞樣本制備過(guò)程中，離心可能對(duì)細(xì)胞造成諸多缺陷，例如：對(duì)細(xì)胞造成擠壓和破壞；不可控的細(xì)胞丟失使得原始樣本中的細(xì)胞群比列產(chǎn)生偏差，導(dǎo)致數(shù)據(jù)嚴(yán)重失真，讓研究者可能得到不客觀的數(shù)據(jù)分析和診斷結(jié)果，此外，傳統(tǒng)離心法還顯著受到操作者差異性的影響，并且需要消耗大量的人力和物力。
因此，想要獲得更加科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，邁入可定量、可重復(fù)性的流式細(xì)胞分析新境界，提升細(xì)胞制備過(guò)程是關(guān)鍵所在。
da-cell微滴陣列樣品前處理系統(tǒng)作為新一代樣品前處理系統(tǒng)，利用重力與層流的效應(yīng)，可以在不用離心的情況下用非常輕柔和科學(xué)的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞，微珠等懸浮樣品的清洗操作。其在細(xì)胞制備過(guò)程中展現(xiàn)出來(lái)的優(yōu)勢(shì)，是目前傳統(tǒng)離心方法所*的。
adicet bio是一家專(zhuān)注于細(xì)胞免疫治療研發(fā)的公司，在 2016年與再生元(regeneron pharmaceuticals)簽訂了一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)5年的合作協(xié)議，旨在實(shí)體腫瘤和血液腫瘤等多個(gè)項(xiàng)目開(kāi)展合作(包括同種異體細(xì)胞療法)。為了能夠接合并殺死腫瘤細(xì)胞，adicet bio正在開(kāi)發(fā)基于γδt細(xì)胞的工程化嵌合抗原受體(car)和t細(xì)胞受體(tcr)，以特異性靶向細(xì)胞內(nèi)外抗原，為多種血液腫瘤和實(shí)體腫瘤提供多元化的臨床候選產(chǎn)品。
γδt細(xì)胞(icp)產(chǎn)品在體外制備過(guò)程包括以下步驟：
1. 從健康捐贈(zèng)者身上分離提取γδt細(xì)胞
2. 對(duì)γδt細(xì)胞進(jìn)行基因改造
3. γδt細(xì)胞擴(kuò)增
4. 擴(kuò)增后的γδt細(xì)胞產(chǎn)品存入細(xì)胞銀行，以備后續(xù)使用
圖1. γδt細(xì)胞產(chǎn)品體外制備流程
adicet bio公司于第2, 3, 4步驟采用基于流式細(xì)胞術(shù)的分選方案對(duì)不同的捐贈(zèng)者進(jìn)行樣本選擇和質(zhì)控，以確保后續(xù)用于治療的產(chǎn)品符合要求。γδt在人體血液中的含量非常低，如果在樣本制備過(guò)程中捐贈(zèng)者的細(xì)胞丟失嚴(yán)重，可能會(huì)導(dǎo)致研究人員對(duì)結(jié)果誤判。為了避免這種情況，并獲取到更真實(shí)和科學(xué)的流式數(shù)據(jù)，挑選到合適的樣本，adicet bio公司研究人員在分選方案的細(xì)胞樣本制備過(guò)程中使用了da-cell微滴陣列樣品前處理系統(tǒng)。
圖2. 捐贈(zèng)者的樣本含有不同比例的γδt細(xì)胞
圖3. 基于流式細(xì)胞術(shù)的樣本分選方案
結(jié)果一：da-cell可提升流式數(shù)據(jù)質(zhì)量
高質(zhì)量的流式細(xì)胞數(shù)據(jù)可以幫助研究人員正確分選捐贈(zèng)者樣本和質(zhì)控，減少因假陽(yáng)性結(jié)果產(chǎn)生的誤判。
結(jié)果二：da-cell使實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高
da-cell自動(dòng)化程度高，避免了人工操作的誤差，極大的提升了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，即使樣本稀有，也可獲得較高的重復(fù)性。
結(jié)果三：：da-cell的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性程度高
細(xì)胞樣本無(wú)論經(jīng)過(guò)da-cell幾次處理，細(xì)胞亞群的比例保持一致，避免數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差。
結(jié)果四：da-cell節(jié)省大量時(shí)間
da-cell 自動(dòng)化程度高，僅需要傳統(tǒng)離心方法的10-20%的時(shí)間，從而提升實(shí)驗(yàn)效率。
總結(jié)
da-cell 微滴陣列樣品前處理系統(tǒng)了傳統(tǒng)的離心方式，其原理是利用重力和流體力學(xué)的層流效應(yīng)，在非離心的情況下，用非常輕柔和科學(xué)的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、微珠等懸浮樣品的清洗操作。與傳統(tǒng)的離心方式下相比，da-cell 展現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢(shì)：
1. 杜絕因傳統(tǒng)離心法造成的數(shù)據(jù)偏差、得到更加科學(xué)的結(jié)果
由于不同細(xì)胞的大小、密度、形態(tài)等各不相同，它們?cè)趥鹘y(tǒng)離心法處理過(guò)程中丟失的比例各不相同，保留的比例已經(jīng)偏離原始的真實(shí)值，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的偏差、甚至錯(cuò)誤。而 da-cell 方法細(xì)胞丟失很少，可地保留原始的細(xì)胞比例，有助于得到更加真實(shí)、科學(xué)的結(jié)果。
△ 傳統(tǒng)離?法只保留20-30%細(xì)胞樣品，da-cell可保留95%以上的細(xì)胞樣品
△ 相較傳統(tǒng)離??式，da-cell可呈現(xiàn)更強(qiáng)的熒光訊號(hào)與完整細(xì)胞形態(tài)
△ 離?過(guò)程對(duì)細(xì)胞所造成的擠壓會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的?理功能與蛋?表達(dá)
2. 節(jié)省時(shí)間、提升效率和通量
傳統(tǒng)離心與da-cell方法制備細(xì)胞樣本流程比較
傳統(tǒng)離心法每次清洗都有多個(gè)步驟，包括：加液、重懸、離心、去上清等，如果清洗 2-4 次就需要 20-40 分鐘，而 da-cell 方法則僅需要 2-6 分鐘，僅需要傳統(tǒng)方法10-20%的時(shí)間。
3. 樣品處理過(guò)程非常溫和，杜絕壓力和細(xì)胞破損
傳統(tǒng)細(xì)胞、微珠等懸浮樣品的制備都必須通過(guò)離心，離心力達(dá)到數(shù)百 g 或數(shù)千 g（即細(xì)胞需要承受相當(dāng)于自身重量的數(shù)百或數(shù)千倍的壓力），這對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響極大，甚至產(chǎn)生破碎；而 da-cell 僅利用細(xì)胞自身的重力和流體力學(xué)的層流效應(yīng)既可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的制備過(guò)程，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有任何脅迫，所以可以顯著減少細(xì)胞破損。
△ 比較pbmc樣品經(jīng)過(guò)4x的da-cell處理 vs 4x的離心處理對(duì)細(xì)胞活率的影響
△ da-cell在活細(xì)胞的比率上顯著高過(guò)傳統(tǒng)離心法
△ 數(shù)據(jù)顯示傳統(tǒng)離心法相較da-cell容易造成更多的細(xì)胞損傷，甚至細(xì)胞死亡
4. 減少細(xì)胞脅迫、保持原始的蛋白和生物標(biāo)志物表達(dá)水平
減少細(xì)胞脅迫、保持原始的蛋白和生物標(biāo)志物表達(dá)水平傳統(tǒng)離心的方式會(huì)對(duì)細(xì)胞等懸浮樣品產(chǎn)品大量脅迫，這會(huì)影響很多基因的表達(dá)水平，并終很可能影響科學(xué)家所要觀察的蛋白和生物標(biāo)志物，從而產(chǎn)生有偏差的數(shù)據(jù)。da-cell 微滴陣列樣品前處理系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的壓力和干擾很小，可以降低對(duì)蛋白和生物標(biāo)志物表達(dá)水平的干擾。
△ 數(shù)值為正數(shù)代表染色指數(shù)較高，使用da-cell后，蛋白染色度相對(duì)增加
△ 有效觀測(cè)蛋白和生物標(biāo)志物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀
5. 提升流式分析數(shù)據(jù)結(jié)果
da-cel可以在不用離心的情況下用非常輕柔和科學(xué)的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，所獲得的數(shù)據(jù)即使進(jìn)行多色流式分析，也可以輕易得到可靠的細(xì)胞分群結(jié)果。
樣品分別在傳統(tǒng)離心法與da-cell處理過(guò)后，在16色熒光流式分析的比較
△ hsc/inkt ：da-cell因可減少細(xì)胞與訊號(hào)的丟失，可讓實(shí)驗(yàn)者看到稀有細(xì)胞亞群，傳統(tǒng)離?法則無(wú)
△ gdt/mait：da-cell可顯著的提升細(xì)胞亞群間界線，傳統(tǒng)離?法就因過(guò)多細(xì)胞碎?易造成區(qū)分困難
6. 全自動(dòng)操作、更好的可重復(fù)性、避免人工導(dǎo)入的偏差
傳統(tǒng)離心法的人工因素很多，由于不同人的操作手法不一樣、同一個(gè)人在不同時(shí)間的操作手法也難以保持一致，因此實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性較差；而 da-cell 是全自動(dòng)操作，避免人工導(dǎo)入的誤差，可極大提升實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。
魔鬼藏在細(xì)節(jié)里，細(xì)節(jié)決定成敗，da-cell可在細(xì)胞處理的細(xì)節(jié)上改善數(shù)據(jù)的質(zhì)量，使流式細(xì)胞分析邁入可定量，可重復(fù)性的新境界，從而提升細(xì)胞免疫治療的監(jiān)控，