*(clodronate disodium，cd)又名氯屈膦酸二鈉，為代雙 膦酸鹽類化合物，是近20年來發(fā)展起來的抗代謝性骨病的一類新藥。多年臨 床研究表明，*療效穩(wěn)定，副作用較少，是控制骨溶解、修復(fù)溶骨 病灶、減少病理性骨折產(chǎn)生的經(jīng)典藥物之一?！吨袊幍洹?010年版擬收載 該品種。
*分子結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)膦酸基團(tuán)，極性強(qiáng)，易電離，不能在反 相液相色譜柱上保留；而且結(jié)構(gòu)中沒有發(fā)色基團(tuán)，不能用常規(guī)的紫外和熒光 檢測器測定。目前，該藥物的分析方法有容量分析法[1-4]、柱前或柱后衍生離 子色譜法[5-8]分析?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中原料和制劑的含量測定采用容量分 析法，需先破壞*結(jié)構(gòu)產(chǎn)生氯離子，再用*滴定，不僅專屬性 差，而且操作復(fù)雜[1-3]。有國外文獻(xiàn)[9]和進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)[10]用抑制電導(dǎo)型離子 色譜方法測定*注射液有關(guān)物質(zhì)的方法。例如，進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn) 采用離子色譜方法測定*注射液的有關(guān)物質(zhì)[10]，但含量測定則用與 有關(guān)物質(zhì)檢查*不同的色譜方法，需柱后衍生后用紫外光譜檢測，裝置復(fù) 雜，設(shè)備繁多[10,11]。有關(guān)同時(shí)測定*含量及其有關(guān)物質(zhì)的分析方法 尚未見報(bào)道。
離子色譜法是一種分析無機(jī)和有機(jī)陰、陽離子的重要技術(shù)，是普通液相和 氣相色譜分析離子型藥物的重要補(bǔ)充，在藥物分析領(lǐng)域的應(yīng)用不斷增多[12-14]。 本研究用抑制電導(dǎo)型離子色譜法同時(shí)測定*及其制劑的含量和有關(guān) 物質(zhì)。
測試條件
儀器：賽默飛ics系列離子色譜帶淋洗液發(fā)生罐系統(tǒng)。 分析柱: ionpac as11-hc+ionpac ag11-hc，4mm 流動(dòng)相組成：koh梯度淋洗0→20分鐘，20→50 mmol/l；20→24分鐘，50 mmol/l； 24→25分鐘，50→20mmol/l；25→ 30分鐘，20mmol/l。 流速：1.2 ml/min 柱溫：30℃
檢測方式：抑制型電導(dǎo)檢測
進(jìn)樣量：25 µl
樣品前處理
有關(guān)物質(zhì)的樣品制備
精密稱取*約15mg，置10ml量瓶中，用水 溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得原料供試品溶液；精密 量取注射液2ml，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖 勻，即得注射液供試品溶液。分別精密量取上述供試品溶 液1ml，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得 對照溶液
含量測定的樣品制備
精密稱取*對照品約15mg，置100ml量瓶 中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。 精密稱取*約15mg，置100ml量瓶中，用水溶 解并稀釋至刻度，搖勻，即得原料供試品溶液。精密量 取本品2ml，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻， 精密量取本品5ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖 勻，即得注射液供試品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物， 研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于*240mg)， 置100ml量瓶中，加水適量，超聲處理10分鐘，放冷， 加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置 100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得膠囊供試品 溶液。
結(jié)果與討論
1 有關(guān)物質(zhì)
1.1 色譜系統(tǒng)的確定
抑制型電導(dǎo)檢測器對水溶液中離子狀態(tài)存在的成分是 一種具有較高靈敏度的通用型檢測器。naoh或koh是一 種非常理想的淋洗液，淋洗液中的na+或k+在抑制反應(yīng)中 與再生液中h+發(fā)生交換，h+與oh-結(jié)合成低電導(dǎo)的水，使 淋洗液背景的電導(dǎo)大大降低，同時(shí)增加了被測離子的靈敏 度。但這種堿性溶液非常容易吸收空氣中的co2，co2在 堿性溶液中轉(zhuǎn)變成淋洗液強(qiáng)度較oh強(qiáng)的co32-，導(dǎo)致高的 噪音并改變色譜行為。淋洗液在線發(fā)生器可獲得純的oh溶液，與對oh-優(yōu)化的親水性分離柱結(jié)合后能獲得基線變 化極小的梯度淋洗系統(tǒng)，有望成為測定藥品有關(guān)物質(zhì)的一 種通用型分析手段。 抑制型電導(dǎo)檢測離子色譜方法在測定藥品雜質(zhì)方面的 應(yīng)用已有報(bào)道[10,14]。進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)jx20060101采用 了復(fù)雜的曲線梯度洗脫方式，根據(jù)生產(chǎn)工藝只選擇兩種雜 質(zhì)進(jìn)行測定[10]。本文采用常見的線性梯度洗脫方式，主成 分與各種雜質(zhì)分離良好，見圖1
*原料的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還采用與標(biāo)準(zhǔn)氯 化鈉溶液和磷酸鹽溶液比色的方法檢查氯化物和磷酸鹽， 采用間接碘量法檢查亞磷酸鹽，操作過程冗長費(fèi)時(shí)，需用 多種化學(xué)試劑，消耗大量樣品，靈敏度低而且有干擾[1]。 采用新的線性梯度洗脫方法，不僅能將雜質(zhì)與主成分* 分離，而且氯離子、亞磷酸根離子和磷酸根離子均與其他 雜質(zhì)*分離，因此可以替代現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法同時(shí) 準(zhǔn)確測定原料中的氯化物、亞磷酸和磷酸，大大提高檢 驗(yàn)效率。
1.2 檢測限、溶液的穩(wěn)定性和強(qiáng)制破壞實(shí)驗(yàn) 按信噪比為3計(jì)算，*的檢測限約為0.3 ng。
取注射液供試品溶液1份，分別在0小時(shí)、17小時(shí)、 19小時(shí)、20小時(shí)和23小時(shí)后進(jìn)樣，大雜質(zhì)含量和總雜 質(zhì)含量均無明顯變化，主成分峰面積的rsd為0.6%。 取注射液樣品5份，分別用0.1mol/l鹽酸2ml、 0.1mol/l氫氧化鈉溶液2ml、3%*2ml、 100℃加熱1小時(shí)和3000lx強(qiáng)光照射1天處理，考察降解 產(chǎn)物與主成分的分離情況。結(jié)果顯示，溶液狀態(tài)下的氯膦 酸二鈉對熱和氧化不穩(wěn)定(圖2)，加熱和氧化后相對保留 時(shí)間約0.37和0.17的雜質(zhì)含量分別明顯增加；對光、酸和 堿穩(wěn)定。固體狀態(tài)下*性質(zhì)穩(wěn)定，在105℃加熱 18小時(shí)失去四個(gè)結(jié)晶水后雜質(zhì)含量也幾乎未增加。采用 上述色譜條件，破壞性試驗(yàn)產(chǎn)生的各種雜質(zhì)對主成分峰的 測定無干擾。
1.3 樣品的有關(guān)物質(zhì)
分別取對照溶液和取供試品溶液注入色譜儀，記錄色 譜圖，按主成分自身對照法計(jì)算大雜質(zhì)含量和雜質(zhì)總含 量，結(jié)果見表1。*在溶液中受熱不穩(wěn)定，而其 注射液一般采用高溫濕熱滅菌的生產(chǎn)工藝，因此雜質(zhì)含量 比原料明顯增多，需要進(jìn)行控制。c廠批號(hào)為74090的注 射液雜質(zhì)含量少。由于在上述色譜條件下，主成分色譜 峰與各雜質(zhì)色譜峰、各主要雜質(zhì)色譜峰之間均基本*分 離，如有雜質(zhì)對照品，可用更準(zhǔn)確的對照品法或帶校正因 子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)。
2 含量測定
2.1 色譜條件的選擇
在有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件基礎(chǔ)上，將梯度洗脫改為 45mmol koh溶液的等度洗脫測定含量，其他條件相同。 按照注射液和膠囊處方稱取適量的空白輔料配制成供試品 溶液，結(jié)果顯示輔料不干擾主成分的含量測定。用水溶液 中常見的氟、碳酸根、硫酸根、溴、硝酸根和原料中需要 控制的氯、亞磷酸根和磷酸根八種離子與*對照 品溶液混合后進(jìn)樣分析，在上述色譜條件下*與 八種陰離子能*分離（圖3），主成分色譜峰出峰時(shí)間 約為7.2分鐘。
采用抑制型電導(dǎo)檢測器的離子色譜系統(tǒng)比傳統(tǒng)的液相 色譜系統(tǒng)需要更長的平衡時(shí)間。在本文的色譜條件下，一 般需要至少預(yù)先平衡約1天時(shí)間，如抑制器為新抑制器或 長時(shí)間未使用，則需要更長的平衡時(shí)間。適當(dāng)增大抑制器 電流可加快系統(tǒng)的平衡。例如，連續(xù)平衡1天后注射液含 量測定的6次進(jìn)樣重復(fù)性和6小時(shí)溶液穩(wěn)定性分別為0.6% 和0.8%，連續(xù)平衡2天后膠囊含量測定的6次進(jìn)樣重復(fù)性 和6小時(shí)溶液穩(wěn)定性分別為0.2%和0.3%，均優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào) 道的柱后衍生離子色譜法[11]。采用供試品溶液與對照品 溶液平行進(jìn)樣的方式也能減少抑制型電導(dǎo)離子色譜方法 的誤差。
2.2 回收率
按注射液和膠囊處方，分別精密稱取*和輔 料適量，配成相當(dāng)于測試濃度80%、100%和120%的三 種濃度的溶液，每個(gè)濃度各三份供試品溶液，按上述方法 測定含量，注射液和膠囊的平均回收率為分別為100.1% 和98.9%，rsd分別為0.7%和0.6% (n=9)。
2.3 線性范圍、重復(fù)性和溶液的穩(wěn)定性 精密稱取四水*對照品23.85mg，置 100ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取3ml、5 ml、7 ml、8ml分別置 10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖 勻，分別進(jìn)樣測定。以峰面積a對濃度c進(jìn)行線性回歸， 得回歸方程為a = 50.151c－0.255 (r=0.9999，n=5)。表 明*濃度在0.0568～0.1895mg/ml范圍內(nèi)，峰面 積與測定濃度呈良好的線性關(guān)系。
取注射液和膠囊供試品溶液各一份連續(xù)進(jìn)樣6次，主 成分峰面積的rsd%分別為0.6%和0.2%。 取注射液和膠囊供試品溶液各1份，分別連續(xù)6小時(shí) 進(jìn)樣，主成分峰面積的rsd分別為0.8%和0.3%。
2.4 樣品含量測定
分別取對照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法 以峰面積計(jì)算含量，測定結(jié)果與原方法的比較見表1。其 中，原料為按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的容量分析法檢驗(yàn)，按干燥品 計(jì)算的含量結(jié)果；制劑為廠家按照現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的自檢結(jié) 果?？梢钥闯觯x子色譜方法與原方法的測定結(jié)果基本一 致。該方法無需對樣品進(jìn)行特殊處理，操作更簡單，檢驗(yàn) 更快捷，專屬性更強(qiáng)。
結(jié)論
賽默飛ics系列離子色譜在檢測離子型或可離子化藥物方面具有很 大的優(yōu)勢。*在水溶液中呈弱酸性，在堿性介質(zhì) 中可轉(zhuǎn)變成為陰離子，因此可以用離子色譜法測定其含 量及有關(guān)物質(zhì)。本研究應(yīng)用抑制電導(dǎo)型離子色譜法同時(shí)測 定*及其制劑的有關(guān)物質(zhì)和含量，方法準(zhǔn)確、靈 敏、專屬、快速，避免了復(fù)雜的樣品預(yù)處理和衍生化過 程，同時(shí)測定多種組分，能更好地控制*及其制 劑的產(chǎn)品質(zhì)量。