實時熒光定量pcr技術(shù)，是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個pcr進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。pcr實驗是分子生物學中常見用的實驗之一，在基因擴增、核酸檢測、基因檢測等方面廣泛應(yīng)用。pcr實驗前的準備:在開始pcr實驗之前，必須準備好dna模板（基因組dna或逆轉(zhuǎn)錄制備的cdna）、特異性引物（自己設(shè)計或用軟件設(shè)計），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實驗目的的酶)
1、dna聚合酶。有許多商業(yè)dna聚合酶，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通taq聚合酶。如果您想對沒有任何突變的特定dna片段進行pcr，請選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測特定序列的存在，就選擇普通的taq聚合酶。如果要對t-vector連接的片段進行pcr，要注意，因為大多數(shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒有a-tailing，所以應(yīng)該選擇普通的taq聚合酶或在pcr實驗后添加a-tailing。
2、引物的特異性影響pcr成功的概率，良好的引物設(shè)計對pcr擴增的成功至關(guān)重要。當您開始設(shè)計引物時，應(yīng)仔細考慮以下幾個原則：①引物的長度。pcr引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來說是足夠長的。②熔化溫度(tm)。tm定義為在此溫度下，dna雙鏈體的一半將解離成單鏈dna。52-58c范圍內(nèi)的引物tm是最佳的。③gc含量。最佳gc含量應(yīng)為40-60%。④許多軟件可用于引物設(shè)計，例如primer5和oligo。這些軟件推薦的引物通?？梢詽M足我們的需求。