新品│高效尿嘧啶特異性切割酶：精準(zhǔn)清除du堿基！
uracil-specific excision reagent是由尿嘧啶dna糖基化酶（uracil dna glycosylase, udg）和核酸內(nèi)切酶ⅷ(endonuclease viii, endo ⅷ)（戳鏈接了解詳情）兩種酶混合而成。udg識(shí)別ssdna或dsdna上的du堿基并形成ap位點(diǎn)，但磷酸二酯骨架結(jié)構(gòu)保持完整。endo viii的裂解酶活性能夠使ap位點(diǎn)的3′和5′端的磷酸二酯鍵斷裂，釋放無(wú)堿基的脫氧核糖，形成單核苷酸間隙。因此，uracil-specific excision reagent（尿嘧啶-特異性切除試劑）能作用于dna上的du位置，產(chǎn)生一個(gè)單核苷酸缺口，適用于ssdna、dsdna及環(huán)狀dna，滿足各類特異性切割du堿基的實(shí)驗(yàn)需求。
圖1.切割du堿基示意圖
uracil-specific excision reagent的應(yīng)用一、rna鏈特異性文庫(kù)rna測(cè)序（rna-seq）已成為全轉(zhuǎn)錄組水平研究差異基因表達(dá)和mrna差異剪接的工具，具有更準(zhǔn)確、可重復(fù)、廣泛和可靠的特點(diǎn)。rna-seq的基本流程包括：提取rna、建立cdna文庫(kù)、上機(jī)擴(kuò)增測(cè)序、數(shù)據(jù)分析。其中rna-seq文庫(kù)構(gòu)建包括常規(guī)建庫(kù)和rna鏈特異性建庫(kù)兩種方法。利用du標(biāo)記一條鏈，uracil-specific excision reagent使標(biāo)記鏈被降解，可以實(shí)現(xiàn)鏈特異性rna-seq文庫(kù)構(gòu)建（圖2）。相比于常規(guī)rna-seq文庫(kù)，鏈特異性rna-seq保留了轉(zhuǎn)錄本的方向信息，可以確定reads是來源于正鏈或負(fù)鏈，使得基因定量和可變剪切事件檢測(cè)更準(zhǔn)確。
圖2.常規(guī)rna建庫(kù)與鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建對(duì)比[1]
二、基于尿嘧啶切除的克隆該方法依賴于含有重疊序列的pcr產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)縫組裝，不需要依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶，可用于多個(gè)pcr片段的組裝、核苷酸序列的修改以及定向克隆。操作流程：1、pcr引物5′端具有重疊序列，包含一個(gè)du堿基，該堿基在與5′末端6- 10 nt距離處取代dt；
2、通過pcr在目標(biāo)dna分子和克隆載體之間生成6-10個(gè)堿基的同源性片段，并且每個(gè)pcr產(chǎn)物的5'端被引入了一個(gè)du；
3、使用uracil-specific excision reagent處理pcr片段，在每個(gè)du位置形成單核苷酸缺口，產(chǎn)生適合于pcr片段定向組裝的3′單鏈延伸；
4、退火延伸完成組裝。
圖3.克隆示意圖
翌圣uracil-specific excision reagent翌圣基于分子酶改造平臺(tái)——zymeeditor™，經(jīng)重組表達(dá)獲得高純度、無(wú)核酸酶殘留的endo viii（cat#14536es）與udg(cat#14455es)，并按照一定比例混合兩種酶產(chǎn)品，形成翌圣uracil-specific excision reagent（cat#14537es）。翌圣uracil-specific excision reagent無(wú)核酸酶、rnase殘留，與進(jìn)口品牌n*的切除效果一致。
數(shù)據(jù)展示與進(jìn)口n*的切除效果一致分別使用翌圣的uracil-specific excision reagent（1 u/μl）與進(jìn)口品牌n*的同類產(chǎn)品（1 u/μl）催化10 pmol雙鏈dna，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，翌圣uracil-specific excision reagent與進(jìn)口品牌n*的堿基切除效果一致（圖4）。
圖4.切除效果對(duì)比
相關(guān)產(chǎn)品推薦應(yīng)用
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品貨號(hào)
基于尿嘧啶切除的克隆、
rna鏈特異性建庫(kù)
uracil-specific excision reagent(1 u/μl)
14537es
dna損傷修復(fù)研究
endonuclease viii (10 u/μl)
14536es
pcr防污染
uracil dna glycosylase (udg/ung), 1 u/μl
14455es