1.什么是酵母展示平臺(tái)
酵母展示（或酵母表面展示）是一種強(qiáng)大的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，它是用整合到酵母細(xì)胞壁中的重組蛋白的表達(dá)來(lái)分離和工程化抗體。自 2000 年發(fā)表以來(lái)，酵母表面展示已被廣泛用于設(shè)計(jì)各種蛋白質(zhì)以提高親和力、特異性、表達(dá)、穩(wěn)定性和催化活性。
2.酵母展示原理
酵母抗體展示技術(shù)（yeast display technology）是指用抗體序列可變區(qū)與凝集素aga2p融合表達(dá)，aga2p蛋白亞基通過(guò)兩個(gè)二硫鍵與固定在酵母細(xì)胞壁上的aga1p 蛋白亞基結(jié)合，結(jié)合流式分選技術(shù)，將靶向抗原的特異性抗體給篩選出來(lái)。
圖1：酵母文庫(kù)展示示意圖
3.納米抗體
納米抗體（nanobody, nbs）是駝科動(dòng)物外周血清產(chǎn)生的一種單鏈抗體，這些抗體僅由重鏈組成，缺乏輕鏈和功能性ch1和ch4結(jié)構(gòu)域。vhh晶體為2.5nm，長(zhǎng)4nm，分子量只有15kda。相較于傳統(tǒng)抗體，納米抗體因其分子量小，從而更容易可穿透血腦屏障；原核或真核系統(tǒng)有高表達(dá)量；特異性強(qiáng)，親和力高；對(duì)人的免疫原性弱等優(yōu)點(diǎn)，因此在抗腫瘤藥物研發(fā)、心腦血管疾病、免疫疾病等領(lǐng)域有巨大價(jià)值。
圖2：納米抗體的3d結(jié)構(gòu)
4.納米抗體酵母展示優(yōu)缺點(diǎn)
4.1優(yōu)點(diǎn)
（1）酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可以進(jìn)行翻譯后修飾來(lái)表達(dá)和折疊復(fù)雜的真核蛋白；
（2)）相對(duì)噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)而言，酵母展示技術(shù)在微量抗體表達(dá)后抗體活性要高，得益此基礎(chǔ)，在流式篩選時(shí)就能區(qū)分抗體的親和力高低；
（3）插入異源蛋白不會(huì)破壞表面蛋白的結(jié)構(gòu)，也不會(huì)影響表面展示的效率。
4.2缺點(diǎn)
（1）相比于噬菌體展示技術(shù)，酵母展示庫(kù)容量較低，因此主要應(yīng)用于客戶(hù)對(duì)項(xiàng)目庫(kù)容要求不高，動(dòng)物免疫后pbmc細(xì)胞經(jīng)過(guò)二次分選以及避免漏掉二硫鍵形成的抗體發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目；
（2）由于酵母表面存在多個(gè)蛋白質(zhì)拷貝，可能會(huì)發(fā)生與寡聚蛋白靶標(biāo)不希望的多價(jià)結(jié)合。
5.酵母抗體展示應(yīng)用
隨著這項(xiàng)技術(shù)的不斷完善，現(xiàn)在酵母展示的應(yīng)用包括酶工程；蛋白質(zhì)表位作圖、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的鑒定、免疫生物催化和生物傳感器，以及用于生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的酵母細(xì)胞上蛋白質(zhì)和酶的展示。
6.泰克生物能夠提供酵母抗體展示技術(shù)服務(wù)
泰克生物能夠?yàn)榭蛻?hù)提供高質(zhì)量的納米抗體酵母展示服務(wù)，主要服務(wù)流程如下：抗原準(zhǔn)備，羊駝免疫，pbmc分離，rna提取，cdna制備，文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)篩選，抗體表達(dá)。
圖3：酵母抗體展示文庫(kù)流程圖
5.1抗原制備
5.1.1密碼子優(yōu)化+基因模板合成+表達(dá)載體構(gòu)建；
5.1.2質(zhì)粒抽提+轉(zhuǎn)染（哺乳表達(dá)系統(tǒng)）目的蛋白檢測(cè)（wb，sds-page）；
5.1.3蛋白表達(dá)放大+蛋白親和純化。
5.2動(dòng)物免疫
5.2.1動(dòng)物免疫4次，加強(qiáng)免疫一針，共計(jì)免疫5針；
5.2.2免疫前采集陰性血清，第4針采血進(jìn)行elisa檢測(cè)血清效價(jià)；
5.2.3若第4針血清抗體效價(jià)（蛋白抗原>105；多肽抗原>104）滿(mǎn)足要求，則采血前7天再次加強(qiáng)免疫1針，如不滿(mǎn)足要求，則繼續(xù)常規(guī)免疫；
5.2.4效價(jià)合格，采血（＞100ml）分離單核細(xì)胞。
5.3 cdna制備
5.3.1 pbmc總rna提?。▍⒄誶na提取試劑盒）；
5.3.2高保真rt-pcr制備cdna（參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒）。
5.4文庫(kù)制備
5.4.1以cdna為模板，兩輪pcr擴(kuò)增vhh基因；
5.4.2酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化： vhh基因拼接酵母展示載體，電擊轉(zhuǎn)化酵母宿主菌，構(gòu)建抗體庫(kù)，電擊次數(shù)不低于10次；
5.4.3鑒定：隨機(jī)挑選24個(gè)克隆，pcr鑒定陽(yáng)性率+pcr鑒定多樣性+插入率。
圖4：vhh陽(yáng)性率:>90%
5.5文庫(kù)篩選
5.5.1磁珠分選；
5.5.2 facs分選（免疫雙標(biāo)分選）；
5.5.3鋪板+陽(yáng)性克隆菌培養(yǎng)+抗體基因測(cè)序；（>20個(gè)，多達(dá)96個(gè)）。
5.6抗體表達(dá)
5.6.1將獲得的抗體序列構(gòu)建合適的表達(dá)載體（哺乳表達(dá)）進(jìn)行表達(dá)+親和純化+抗體蛋白定量；
圖5：fc-vhh納米抗體表達(dá)結(jié)果圖片
5.6.2 elisa驗(yàn)證抗體與抗原結(jié)合，進(jìn)行下游驗(yàn)證（交付ec50數(shù)據(jù)）;
5.6.3 bli法驗(yàn)證抗體親和力；
5.6.4細(xì)胞功能驗(yàn)證：流式驗(yàn)證；
5.6.5驗(yàn)證細(xì)胞系（抗原受體過(guò)表達(dá)細(xì)胞系）。
7.酵母展示服務(wù)優(yōu)勢(shì)
（1）物種適應(yīng)性廣泛：人，鼠，兔，羊，羊駝，駱駝，魚(yú)等物種的單抗開(kāi)發(fā)均兼容
（2）技術(shù)平臺(tái)成熟：提供的1級(jí)免疫文庫(kù)的建庫(kù)庫(kù)容為106-107；插入率均滿(mǎn)足>95%，篩選獲得的抗體親和力普遍處于nm-pm級(jí)別
（3）開(kāi)發(fā)周期短：獲得pbmc后，建庫(kù)到篩選獲得抗體序列，3-4周
（4）產(chǎn)品交付標(biāo)準(zhǔn)高：針對(duì)免疫庫(kù)，交付免疫前后血清，抗體展示文庫(kù)，酵母表達(dá)菌株，抗體序列
隨著抗體庫(kù)技術(shù)的不斷發(fā)展，噬菌體展示抗體文庫(kù)已經(jīng)生產(chǎn)了大量的高活性抗體，噬菌體展示技術(shù)的廣泛應(yīng)用促使科學(xué)家對(duì)于酵母文庫(kù)技術(shù)的不斷探索。酵母展示技術(shù)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，相比于噬菌體展示系統(tǒng)有其的優(yōu)勢(shì)，因此在人類(lèi)治療和診斷領(lǐng)域也占據(jù)著重要地位。