核糖體是細(xì)胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒（ribonucleoprotein particle），主要由rna和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其唯yi功能是按照mrna的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈，所以核糖體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器。核糖體無膜結(jié)構(gòu)，主要由蛋白質(zhì)（40%）和rna（60%）構(gòu)成。核糖體按沉降系數(shù)分為兩類，一類（70s）存在于細(xì)菌等原核生物中，另一類（80s）存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
ribolace mod. 1核糖體提取試劑盒是一款由immaginabiotechnology公司基于嘌呤霉素（嘌呤霉素是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,它具有與trna分子末端類似的結(jié)構(gòu),能夠同氨基酸結(jié)合,代替氨?；膖rna同核糖體的a位點結(jié)合）通過無抗體、無融合標(biāo)簽蛋白的pull-down技術(shù)來分離活性核糖體的試劑盒。
操作使用
實驗流程圖
（1）實驗前準(zhǔn)備
另外需自備的材料
l10% 脫氧膽酸鈉（dnase/rnase free water）
lcycloheximide
lribolock rnase抑制劑
lsuperase•in™ rna酶抑制劑
l無rna酶和depc水
l酸酚-氯仿混合液
lnanodrop nd-1000 uv-vis分光光度計
l糖原藍(lán)色染料
l異丙醇
l微型離心機(jī)和無rna酶微量離心管（0.2 ml和1.5 ml）
l旋轉(zhuǎn)器
l用于1.5ml試管的磁力支架
a.稀釋ribolace smart probe：在ribolace smart probe中加入316.5 μl b-buffer，然后在冰上解凍。使用后，建議將混合物等分，并儲存于-80℃，避免兩次以上的反復(fù)凍融。
b.在裂解緩沖液lysis buffer使用前添加以下成分：脫氧膽酸鈉（1%終濃度）、5u/ml dnase i和200u/ml ribolock rnase抑制劑。
（2）裂解
貼壁細(xì)胞裂解
a.裂解前，使用10 µg/ml的環(huán)己酰亞胺（chx）在37℃下處理細(xì)胞5 min。我們建議使用70-80 %匯合的細(xì)胞。chx處理可提高核糖體親和純化的效率，可選步驟。如果您使用的是人體或小鼠組織，請注意裂解緩沖液和w-緩沖液中都含有chx（10 ng/ml）。
b.孵育后，將細(xì)胞置于冰上，并用含有chx（20 µg/ml）的冷pbs快速洗滌。
c.用移液槍去除pbs
d.將加入了脫氧膽酸鈉（1%終濃度）、5u/ml dnase i和200u/ml ribolock rnase抑制劑的裂解液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行裂解，并用力刮擦（適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刮擦對有效裂解很重要）。
e.在1.5 ml離心管中收集細(xì)胞裂解物，并在20000 g離心5 min。
f.將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，冰浴20 min。
g.使用nanodrop分光光度計，取1 µl細(xì)胞裂解液，檢測細(xì)胞裂解液在260 nm處的吸光度（設(shè)置nanoddrop的“核酸”功能）
懸浮細(xì)胞裂解
a.裂解前，使用10 µg/ml的環(huán)己酰亞胺（chx）在37℃下處理細(xì)胞5 min。我們建議使用70-80 %匯合的細(xì)胞。chx處理可提高核糖體親和純化的效率，可選步驟。如果您使用的是人體或小鼠組織，請注意裂解緩沖液和w-緩沖液中都含有chx（10 ng/ml）。
b.收集細(xì)胞，在4℃下以950 g離心5 min，棄培養(yǎng)基，用含有chx的冷pbs（20 µg/ml）快速洗滌細(xì)胞。
c.收集并在4℃下以950 g離心5 min。除去上清液，并用加入了脫氧膽酸鈉（1%終濃度）、5u/ml dnase i和200u/ml ribolock rnase抑制劑的裂解液將細(xì)胞重懸。
d.通過g26針（約10次）使細(xì)胞裂解而不產(chǎn)生氣泡。
e.20000 g離心5 min。
f.將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，冰浴20 min。
g.使用nanodrop分光光度計，取1 µl細(xì)胞裂解液，檢測細(xì)胞裂解液在260 nm處的吸光度（設(shè)置nanoddrop的“核酸”功能）
組織裂解
a.用研缽和研杵在液氮下將紙巾碾碎?；厥辗勰┯?.5 ml試管中
b.每10 mg組織加入800 µl 組織裂解液 (immagina cat. nr. #rl001-2)，請注意裂解緩沖液和w-緩沖液中都含有chx（10 ng/ml）。
c.20000g離心2min并收集上清液。
d.再次以20000g離心上清液5min，并收集上清液，冰浴20min。
e.使用nanodrop分光光度計，取1 µl細(xì)胞裂解液，檢測細(xì)胞裂解液在260 nm處的吸光度（設(shè)置nanoddrop的“核酸”功能）
（3）磁珠處理
a.從4°c下取出ribolace磁珠，并將試管置于rt下至少30分鐘。
b.將ribolace磁珠管渦旋30秒以上。
c.加入90µl ribolace磁珠至新的1.5 ml試管中。最終體積=90µl x n（n=樣品數(shù)量），隨后置于磁力架上，去除上清液。
d.取下試管，用等體積（90µl x n）的oh緩沖液洗滌ribolace磁珠5分鐘，然后棄掉上清液。
e.向離心管中加入900µl不含核酸酶的水洗滌磁珠。
f.加入體積為（90µl x n）的b-緩沖液洗滌珠子，3分鐘，共兩次。將試管放于磁力架上至少1分鐘，然后棄上清液。
g.加入（30µl x n）體積的稀釋的ribolacesmart probe，1400 rpm室溫孵育1 h，注意不要讓磁珠沉淀，在孵育期間，可以進(jìn)行核酸酶處理的步驟。
h.另取2 µl 已稀釋的ribolace smart probe保存于冰上，作為后續(xù)驗證。
i.孵育后，將試管放在磁力架上，留存3µl上清液作為驗證。
j.向管中加入一定體積（3 µl x n）mpeg，在室溫下在振蕩器中混勻15min。注意不要讓磁珠沉淀。
k.將試管置于磁力架上2-3min，棄上清液，加入500µl不含核酸酶的水洗滌。
l.加入500µl w緩沖液清洗磁珠，兩次。
m.加入200µl的w緩沖液將ribolace磁珠重新懸浮，并根據(jù)樣品的（n）個數(shù)將結(jié)合的磁珠等分。注意不要讓磁珠變干。
n.結(jié)合效率的預(yù)估：將孵育后的上清液與未與磁珠孵育的ribolace smart probe在270 nm（nanodrop nd-1000）處的吸光度進(jìn)行比較，可以估計磁珠結(jié)合效率（預(yù)計吸光度降低約10-50%）。
（4）核酸酶處理
a.將w緩沖液加入總體積為0.1-0.3 a. u（260nm）的裂解液，至最終體積為150µl。
b.加入0.3µlstabilizing nux solution (ss)，吸打混勻。
c.取2 ml管，加入1.5 µl核酸酶（nux），并加入98.5µl w緩沖液（wb）。用移液槍吸打5次，使稀釋的nux溶液充分混勻。
d.加入稀釋的核酸酶（nux）溶液于1.5 ml離心管中，25°c處理樣品45min，核酸酶（nux）溶液使用體積（µl）為a.u x 5。
e.加入0.5µlsuperase•in™ rna酶抑制劑，冰浴10min。
（5）核糖體pull-down
僅在添加細(xì)胞裂解液之前，去除w緩沖液（步驟3.m中）
a.向步驟3.m中處理過的磁珠中加入處理過的細(xì)胞裂解液并充分混合。
b.4°c，慢速（3 rpm）孵育70分鐘。
c.取出離心管，不要離心，置于冰浴的磁力架上，保持在冰上操作，分離磁珠。
注意不要將磁珠從磁力架上取下，也不要觸摸磁珠。
d.500µl w緩沖液小心清洗磁珠兩次。
e.從磁力架上取下，并用200µl w緩沖液將磁珠重懸。
f.將磁珠懸浮液轉(zhuǎn)移至新的不含核酸酶的1.5ml離心管中。
（6）核糖體分離
a.向磁珠懸浮液中加入20µl 10%sds和5µl蛋白酶k，并在37°c水浴75min。
b.加入225µl酸性苯酚、氯仿、異戊醇混合物。
c.渦旋混勻，14000g離心5min。
d.如果離心后沒有分離，可加入20µl2 mnacl（depc水），再次離心。
e.保留水相并將其轉(zhuǎn)移至新的瓶中。
f.加入500µl異丙醇和2µl糖源藍(lán)色染料。
g.混合并室溫孵育3min，然后在-80°c下儲存：
至少2小時或過夜。
h.4°c下離心（20000g）30min。
i.加入5µl無核酸酶水將rna沉淀重懸。
j.使用pagext試劑盒（cat. no##kge002_12）進(jìn)行rpfs page純化。
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ribolace mod. 1
#rl001_mod. 1_12
12
上海起發(fā)實驗試劑有限公司
常見問題
1.在進(jìn)行ribolacepull-down之前，需要用環(huán)己酰亞胺處理細(xì)胞嗎？
答：chx（環(huán)己酰胺）存在于試劑盒中包含的裂解液（lb）以及w緩沖液（wb）中。ribolace在使用或不使用環(huán)己酰亞胺的情況下都能很好地發(fā)揮作用。也就是說，細(xì)胞是否添加chx處理取決于實驗設(shè)置。一些客戶在起始密碼子周圍發(fā)現(xiàn)了由于chx引起的p位點周期性偽影。相反，chx可以使核糖體保護(hù)片段的長度在28個核苷酸處向更均勻的峰值移動。根據(jù)我們的經(jīng)驗，20 µg/ml的chx略微改善了p位點沿編碼區(qū)的分辨率周期性。例如，從沒有進(jìn)行chx處理的快速冷凍腦組織中獲得了良好的p位點周期性。如果您的樣品易流失核糖體，我們建議增加w緩沖液中的chx濃度（目前為20 µg/ml，至40 µg/ml），并在每個w緩沖液中加入30 ml chx儲備溶液（10 mg/ml）。
2.應(yīng)該如何冷凍ribolace實驗的樣品？
答：對于使用chx裂解細(xì)胞，我們建議在進(jìn)行ribolace之前進(jìn)行細(xì)胞裂解，并將其保存在-80的溫度下，保存時間最多1-2個月。
對于不使用chx裂解細(xì)胞，我們建議在進(jìn)行ribolace之前，快速冷凍并儲存在-80℃下，最多1-2個月。
對于組織樣品，我們建議在進(jìn)行ribolace之前，快速冷凍組織并將樣品儲存（-80℃）最多1-2個月。
3.不能在一天內(nèi)完成所有的步驟。處理過的磁珠可以儲存并第二天繼續(xù)嗎？
答：是的，可以停止。我們建議將磁珠保持在含有ribolace smart probe的溶液中，即在磁珠分離和加入mpeg之前。在室溫1400 rpm孵育1 h后，可以將磁珠在4℃下儲存過夜，不要冷凍。
4.ribolacemod. 1適用于哪些物種？
答：一般來說，ribolace在真核細(xì)胞和組織上效果良好，截至目前，已在哺乳動物細(xì)胞、小鼠和昆蟲組織中得到驗證。
5.試劑盒到貨后有效期多久？
答：12個月
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