中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
gb/t 8381.3-2005
飼料中林可霉素的測定
determination of lincomycin in feed
前言
本標(biāo)準(zhǔn)參考了美國公職分析化學(xué)家協(xié)會（aoac）《公定分析方法》978.31“飼料中的林可霉素 微生物學(xué)方法”和國內(nèi)外有關(guān)林可霉素生產(chǎn)、檢驗等資料，根據(jù)我國飼料工業(yè)的實際情況制定。
本標(biāo)準(zhǔn)的附錄a為規(guī)范性附錄。
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省獸藥飼料監(jiān)察所負(fù)責(zé)起草，吉林省獸藥監(jiān)察所和國家飼料監(jiān)督檢驗測試中心（北京）參加起草。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳瑩瑩、曹東、董永亮、劉雪紅、苗暢海、肖勇、戰(zhàn)石、李廣生、劉同民、楊曙明。
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中林可霉素的測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于濃縮飼料、配合飼料中林可霉素的鑒別和含量測定。
采用本方法鑒別林可霉素的最小含量為10 mg/kg。
采用本方法測定林可霉素定量的檢測限為每千克飼料中含10000林可霉素效價單位。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
gb/t 14699.1飼料采樣
中華人民共和國獸藥典（2000年版一部）
3術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.1
林可素效價單位
用微生物法測定的林可霉素的生物活性單位，用u表示。林可霉素中所含的抗菌活性部分的質(zhì)量與生物活性單位的關(guān)系為1mg相當(dāng)于1000林可霉素效價單位。
4原理
在酸性條件下，用二氯甲烷除去飼料中能夠溶入其中的雜質(zhì)，調(diào)節(jié)液性呈堿性，用二氯甲烷提取溶液中的林可霉素，經(jīng)濃縮、溶劑轉(zhuǎn)換，制成試樣溶液。試樣溶液在硅膠g薄層板上用兩種展開劑展開，與標(biāo)準(zhǔn)品比較rf值，確認(rèn)試樣中是否含有林可霉素；用微生物標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定含量。
5試劑和溶液
除非另有說明，在本分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和蒸餾水。
5.1林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品：符合《中華人民共和國獸藥典》2000年版一部的要求。
5.2藤黃微球菌（micrococcus luteus） cmcc 28001。
5.3 甲醇。
5.4 正己烷。
5.5二氯甲烷。
5.6 硅膠g，薄層層析用。
5.7 碘。
5.8 鹽酸溶液：取鹽酸9 ml，加水至1 000 ml，混勻。
5.9 鹽酸-甲醇，1+1。
5.10氨溶液：取濃氨溶液50 ml，加水至100 ml，混勻。
5.11氨溶液：取濃氨溶液5 ml，加水至100 ml，混勻。
5.12展開劑 1，丁酮-丙酮-水，9.3+2.6+1。
5.13 展開劑2，三氯甲烷-甲醇-濃氨溶液，1+1+1，混合，振搖，靜置至上下兩層均澄清，分取下層混合液備用。
5. 14 林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，加甲醇2 ml使溶解，用二氯甲烷稀釋至濃度為1 mg/ml。當(dāng)天配制。供鑒別用。
5.15 林可霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取50 mg林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.1 mg，用水溶解并稀釋成約含1 000 u/ml的溶液。在2℃~10℃可保存7天。供含量測定用。
6儀器及設(shè)備
6.1 分析天平，感量0.000 1 g。
6.2天平，感量0.01 g。
6.3。振蕩器。
6.4 離心機(jī)。
6.5 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。
6.6 超聲波發(fā)生器。
6.7旋渦式微型混合器。
6.8電熱恒溫水浴鍋。
6.9 注射器，全玻璃，5 ml，配有8＃針頭。
6.10 濃縮瓶，容量10 ml，具塞，底部具0.2 ml刻度尾管。
6. 11 玻璃板，規(guī)格20 cm×10 cm。
6.12展開槽，立式，雙槽 ，規(guī)格10 cm×5 cm×20 cm。
6.13 平底雙碟，直徑約90 mm，高16 mm~17 mm；符合《中華人民共和國獸藥典》2000年版一部的要求。
6.14 不銹鋼小管，高10.0 mm±0.1 mm，外徑8.0 mm±0.1 mm，內(nèi)徑6.0 mm±0.1 mm；符合《中華人民共和國獸藥典》2000年版一部的要求。
6.15恒溫培養(yǎng)箱。
6.16高壓滅菌鍋。
6.17游標(biāo)卡尺（精度0.02mm）或抑菌圈測量儀。
7試樣的制備
將按gb/t 14699.1取得的樣品，四分法縮分，取約200 g，經(jīng)粉碎，全部過1 mm孔篩，混勻，裝入磨口瓶中備用。
8鑒別
8.1凈化
8.1.1 提取
稱取20 g試樣（7），準(zhǔn)確到0.01 g，置150 ml具塞錐形瓶中，加入50 ml甲醇（5.3），振搖30 min，
過濾，取25 ml濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（6.5）上于50℃減壓蒸發(fā)至約5 ml。
8.1.2 轉(zhuǎn)移
將濃縮液轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，用2ml甲醇分次沖洗蒸發(fā)瓶，洗液并入離心管，置60℃水浴（6.8）中蒸干。加0.01 mol/l鹽酸溶液（5.8）2 ml，超聲1 min， 使林可霉素溶解，溶液轉(zhuǎn)移到另一離心管，再向殘渣中加0.01 mol/l， 鹽酸溶液0.5 ml，超聲30 s。
8.1.3 洗滌
合并兩次酸溶液（8.1.2），加入3 ml正己烷（5.4），于微型混合器（6.7）上混合30 s，棄去上層正己烷，用7 ml二氯甲烷（5.5）分三次洗滌酸提取液（3、2、2 ml），每次混合30 s，用注射器（6. 9）吸去下層二氯甲烷。如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可于3000 r/min離心5 min破除乳化，使溶液分層。
8.2試樣溶液的制備
用氨溶液（5.11）調(diào)節(jié)酸提取液（8.1.3）至ph10，用7 ml二氯甲烷分三次（3、2、2 ml）提取溶液中的林可霉素，每次混合1 min，吸出下層二氯甲烷提取液，合并到濃縮瓶（6.10）中，在30℃水浴中蒸干。
放冷至室溫后加入0.2 ml二氯甲烷溶解殘渣，留做薄層層析用。當(dāng)天使用。
8.3 測定
8.3.1薄層板的制備
取8 g硅膠g（5.6） ，加水約24 ml，研磨2 min至呈粘稠狀，鋪成三塊薄層板（6.11），置室溫干燥后，于105℃活化1 h，貯干燥器中備用。一周內(nèi)使用。
8.3.2點樣
取兩塊薄層板（8.3.1），在距下端2 cm處作為基線點樣。每塊板各點三個樣點：50μl林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.14）、25μl試樣溶液（8.2）和25μl林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、50μl試樣溶液，各點間距離應(yīng)不小于1cm。
8.3.3展開
在兩個展開槽內(nèi)分別倒入10 ml展開劑1（5.12）和10 ml展開劑2（5.13） ，將點好樣的兩塊薄層板分別置裝有展開劑的展開槽中（不浸入展開劑中），預(yù)飽和2 h，再浸入展開劑中展開15 cm，取出，通風(fēng)揮干。
8.3.4 顯影
將展開后的薄層板放置在充滿碘（5.7）蒸氣的密閉容器內(nèi)，注意觀察，薄層板上的林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液斑點逐漸顯現(xiàn)直至清晰可見，取出薄層板立即觀察。
8.4 觀察與判定
比較薄層板上各斑點的位置以及顏色，判定方法如下：
——在兩塊薄層板上，試樣溶液在與標(biāo)準(zhǔn)溶液斑點對應(yīng)處均無斑點出現(xiàn)，且混合加樣點的斑點顏色比標(biāo)準(zhǔn)溶液斑點淺，判定試樣中林可霉素陰性；
——兩塊薄層板中其中一塊板上的試樣溶液在與標(biāo)準(zhǔn)溶液斑點對應(yīng)處無斑點出現(xiàn)，而另一塊板出現(xiàn)斑點，判定試樣中林可霉素陰性；
——在兩塊薄層板上，如果試樣溶液在與標(biāo)準(zhǔn)溶液斑點對應(yīng)處均出現(xiàn)斑點，混合加樣點只顯現(xiàn)一個主斑點（與標(biāo)準(zhǔn)品溶液中最大的、顏色最重的斑點對應(yīng)處）且所顯現(xiàn)的斑點與標(biāo)準(zhǔn)溶液斑點的位置及顏色相同，可能判定林可霉素陽性，繼續(xù)以下含量測定。
9含量測定
9. 1菌懸液的制備
取藤黃微球菌（5.2）的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（第a.4章）的培養(yǎng)瓶中，在26℃~27℃培養(yǎng)24 h，或采用適當(dāng)方法制備的菌斜面。用0.9%滅菌氯化鈉溶液（第a.1章）將菌苔洗下，置4℃冰箱保存（不宜超過兩周）。
9.2雙碟的制備
取平板培養(yǎng)基（第a.5章）加熱融化，冷卻至50℃±1℃，加入適量菌懸液（9.1）（以參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液所至抑菌圈直徑在18.5 mm±2 mm為宜），必要時，每100 ml培養(yǎng)基中可加入50%葡萄糖溶液（第a.3章）2 ml，播勻。每1個雙碟（6.13）加入10 ml，均勻攤布，放置水平臺上冷卻，待培養(yǎng)基凝固后，將雙碟倒置于4℃冷藏1 h以上。臨用前取出，在每1個雙碟內(nèi)半徑為2.8 cm圓周上等距離放置6個不銹鋼小管（6.14）。
9.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
9.3.1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液
量取林可霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（5.15），用磷酸鹽緩沖液（ph7.8）稀釋使成0.15 u/ml、0. 30 u/ml、
0.60 u/ml、1.20 u/ml、2.40 u/ml濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以0.60 u/ml為參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
9.3.2 培養(yǎng)
取當(dāng)天制備好的雙碟（9.2）平均分為5組，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（9.3.1）每一濃度為1組。每一個雙碟的6個不銹鋼小管中，間位的3個滴加參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，另外3個滴加該組標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每組滴加至少3個雙碟，于36℃~37℃培養(yǎng)16 h~18 h。
9.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線
測量各組參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和該組標(biāo)準(zhǔn)工作溶液抑菌圈數(shù)值，分別計算平均值，再計算所有雙碟參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液抑菌圈的總均值，作為修正值。各濃度組的抑菌圈數(shù)值按式（1）修正：
aa= ba-b+a……………………（1）
式中：
aa——該濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液被修正后的抑菌圈數(shù)值；
ba——修正值；
b——該濃度組中參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液所至抑菌圈讀數(shù)平均值；
a——該濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液抑菌圈讀數(shù)平均值。
以各組溶液濃度的對數(shù)與該組溶液被修正后的抑菌圈數(shù)值作線性回歸，求出回歸方程。相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不小于0.99。
9.4試樣溶液的制備
9.4.1 提取
稱取15 g試樣（7），精確至10 mg，置150 ml錐形瓶中，準(zhǔn)確加入0.1 mol/l 鹽酸-甲醇（5.9）50 ml，振搖30 min，轉(zhuǎn)移至100 ml離心管中，3 000 r/min離心5 min。
9.4.2 凈化
準(zhǔn)確量取離心管中的上清液（9.4.1）5 ml到125 ml分液漏斗中，加入0.5 ml正己烷，5 ml二氯甲烷，旋搖30s，棄去下層二氯甲烷，反復(fù)操作兩次。
用氨溶液（5.10）調(diào)節(jié)分液漏斗中溶液的ph值至約10（必要時可向溶液中加一滴酚酞指示劑，幫助確認(rèn)），加入10 ml二氯甲烷，旋搖提取1 min，仔細(xì)分出下層二氯甲烷，反復(fù)操作三次。
9.4.3 試樣溶液
合并二氯甲烷提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，低于30℃減壓蒸干，量取磷酸鹽緩沖液適量到蒸發(fā)瓶中，超聲不少于2 min，使殘渣中的林可霉素完全溶出，準(zhǔn)確定容（使溶液中林可霉素的濃度在0.15 u/ml~2.40 u/ml之間）制成試樣溶液。于當(dāng)天使用。
9.5測定
取與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時制備的至少3個雙碟，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法（9.3）分別滴加試樣溶液（9.4.3）和參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時操作和培養(yǎng)。
10 判定與結(jié)果計算
10. 1判定
——試樣溶液不產(chǎn)生抑菌圈，判定林可霉素陰性；
——試樣溶液產(chǎn)生抑菌圈，判定林可霉素陽性并計算含量。
10.2結(jié)果計算
用回歸方程求出標(biāo)準(zhǔn)工作溶液參考濃度對應(yīng)的抑菌圈數(shù)值作為修正值，按式（1）校正試樣溶液抑菌圈讀數(shù)的平均值，再用回歸方程求出試樣溶液中林可霉素的實測濃度（c）。
試樣中林可霉素的含量按式（2）計算：
式中：
w——試樣中林可霉素的含量，單位為林可霉素效價單位每千克（u/kg）；
c——試樣溶液中林可霉素的實測濃度，單位為林可霉素效價單位每毫升（u/ml）；
n——試樣的稀釋倍數(shù)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。
測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留至整數(shù)位。
11重復(fù)性
同一操作者對同一試樣同時兩次平行測定所得結(jié)果的相對偏差不大于20%。