引物：引物是pcr特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，pcr 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板dna互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板dna序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用pcr就可將模板dna在體外大量擴(kuò)增。
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基：g+c含量以40-60%為宜，g+c太少擴(kuò)增效果不佳，g+c過多易出現(xiàn)非特異條帶。atgc最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致pcr失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。