實驗步驟先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)dna 聚合反應(即錯配) ，再次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的聚體或發(fā)夾結構。引物設計應注意如下要點：1．引物的長度般為15-30 bp，常用的是18-27 bp。2．引物序列在模板內應當沒有相似性較，尤其是3’端相似性較的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如ggg 或ccc，也會使錯誤引發(fā)機率增加。3．引物3’端的末位堿基對taq 酶的dna 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為a 的錯配效率明顯于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基a。4．引物序列的gc 含量般為40-60%，過或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的gc含量不能相差太大。5．引物的另個重要參數(shù)是熔解溫度（tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈dna分子時的溫度。合理的退火溫度從55℃到70℃。為獲得結果，兩個引物應具有近似的tm值。6．引物聚體或發(fā)夾結構也可能導致pcr 反應失敗。應該盡量避免。
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